Genes de Reparacion

Published on January 2017 | Categories: Documents | Downloads: 55 | Comments: 0 | Views: 235
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Tema 3.3. Mecanismos de reparación del ADN en
humanos
A. Reparación de desemparejamientos entre nucleótidos normales.
Los mecanismos de reparación mencionados actúan reparando tipos específicos de daño al
ADN. Los desemparejamientos entre bases normales pueden originarse por la tautomería
de las bases (la forma imina de Citosina empareja con Adenina, o la forma enólica de
Timina empareja con Guanina), por desaminación de citosinas metiladas (las citosinas
metiladas de los dinucleótidos CpG se desaminan a Timina), y principalmente por los
errores de la ADN polimerasa durante la replicación del ADN. También se producen
desemparejamientos durante la formación de heteroduplexes en los procesos de
recombinación. Además, el deslizamiento de la cadena nueva sobre la cadena molde
durante la replicación también puede producir bucles de inserción/deleción (IDLs=bucles
de inserción/deleción). Todos estos tipos de desemparejamiento se corrigen por el sistema
MMR (mismatch repair), cuyos componentes conocidos en humanos son hMLH1,
hMSH2, hMSH3, hMSH6, hPMS1, hMLH3 y hPMS2 (homólogos de MutS y MutL de E.
coli). Estas subunidades actúan como heterodímeros hMSH2/hMSH6, que reconocen tanto
los bucles (loops) de inserciones/deleciones de 1 a 8 nucleótidos como los
desemparejamientos simples de una base; o bien actúan como heterodímeros
hMSH2/hMSH3, que reconoce sólo bucles. Cada uno de estos dímeros, a su vez, actúa
junto con los homólogos de MutL, que son hMLH1/hPMS2 y hMLH1/hPMS1
(recientemente se ha descrito también hMLH1/hMLH3). En concreto, los heterodímeros
hMSH2/hMSH6 junto con hMLH1/hPMS2 reparan los desemparejamientos simples,
mientras que cualquiera de los dos complejos (hMSH2/hMSH3 ó hMSH2/hMSH6) en
combinación con hMLH1/hPMS2 son capaces de reparar stem-loops (tallo-bucle)
producidos por IDLs, como se muestra en la figura.
El video de la Figura 3.2 muestra algunos desemparejamientos entre nucleótidos
normales y la formación de los bucles de inserción/deleción. Además, se esquematiza
la estructura y funcionamiento del sistema de reparación de desemparejamientos
MMR (Mismatch Repair System).
En E. coli, este sistema actúa uniéndose al desemparejamiento y a una base metilada
adyacente, corta la cadena no metilada (recién sintetizada) hasta una distancia de 1-2 kb del
mismatch, una endonucleasa corta los nucleótidos contenidos en el asa, y la polimerasa
rellena el hueco. En mamíferos el mecanismo no está todavía totalmente explicado, pero se
ha encontrado una proteína (MBD4 ó MED1) que se une a metil-citosinas, tiene actividad
N-glicosilasa y forma complejos con MLH1, además de modular el sistema de MMR.
Cuando hay defectos en este proceso de reparación aparecen errores durante la replicación
del ADN, errores que se pueden ver al analizar secuencias repetidas cortas tipo
Microsatélite. Por tanto, los defectos en el sistema de reparación de desemparejamientos
dan lugar al fenómeno conocido como Inestabilidad de Microsatélites (MIN= Microstallite
INstability) o "fenotipo mutador". Se conocen algunas enfermedades debidas a mutaciones
en componentes de estos sistemas de reparación. Por ejemplo, 90% de los pacientes con
cáncer colo-rectal no-polipósico hereditario (HNPCC ó Síndrome de Lynch) tienen
mutaciones en uno de los genes hMSH2, hMLH1, hPMS1, hPMS2 o hMSH6, de forma los
individuos que han heredado una mutación en uno de los alelos tienen una alta probabilidad
de sufrir una segunda mutación en el otro alelo en alguna de sus células somáticas, por lo
que el riesgo global de desarrollar este tipo de cáncer es del 80-85% (o del 75% a los 55
años) en estos sujetos. Estos tumores muestran inestabilidad de microsatélites, pero además
la inestabilidad también afecta a genes que tienen repeticiones en sus secuencias
codificantes (BAX, TGFBRII). Son las mutaciones en estos genes las que a menudo llevan
al desarrollo de neoplasias. Curiosamente, los pacientes homocigotos para mutaciones en
MLH1 (dos mutaciones en la línea germinal) desarrollan en la infancia neoplasias
hematológicas además de otros tumores (neurofibromatosis, meduloblastoma), lo que
sugiere la existencia de genes implicados en la hematopoyesis y en el control del
crecimiento celular que son dianas del sistema MMR.
B. Reparación de nucleótidos dañados.
Otros sistemas detectan la presencia de bases anormales tales como, por ejemplo, los
uracilos que aparecen por la des-aminación de una citosina. En general, estas
modificaciones están debidas a la acción de mutágenos (benzopirenos del tabaco, agentes
alquilantes, diversos agentes químicos de la dieta, el daño causado por especies reactivas de
oxígeno, así como las alteraciones debidas a la radiación ultravioleta. Los procesos
químicos que con mayor frecuencia provocan mutaciones son 1) las oxidaciones por
radicales libres, especialmente la formación de 8-oxoguanina, que se empareja con T en
vez de C (se calcula que se forman unas 10.000 al día en cada célula) y 2) las reacciones
hidrolíticas, ya que la molécula de ADN sufre una hidrólisis espontánea lenta que hace que
se pierdan unas 10.000 purinas al día en un genoma humano, con la consiguiente creación
de otros tantos sitios apurínicos. También la radiación UV produce sitios apurínicos, pero
sobre todo provoca dímeros de pirimidinas.
En la Figura 3.3 podemos ver la estructura de algunos nucleótidos anormales que se
generan por la acción de diversos agentes. Por ejemplo, se muestran la 06-metil-
guanina, la 8-oxo-guanina y los dímeros de pirimidinas generados por la acción de la
luz ultravioleta.
En general, todas estas lesiones son graves, ya que impiden la replicación correcta del ADN
y, a la larga, llevan a la muerte celular. Podemos generalizar diciendo que las lesiones del
ADN producidas por la presencia de nucleótidos anormales se corrigen por cuatro
mecanismos: reversión directa, BER (Base Excision Repair), NER (Nucleotide Excision
Repair) ó por polimerasas capaces de pasar por encima de la lesión.
De modo esquemático, el video de la Figura 3.4 muestra los cuatro mecanismos
principales por los que se reparan las lesisones que incluyen nucleótidos dañados.
A continuación se ve con más detalle cada uno de estos mecanismos:
1. Al contrario que otras especies, la reversión directa por enzimas fotoreactivadoras no
existe en humanos. Nuestro único recurso en este sentido consiste en un enzima llamado
MGMT (metil-guanina metil-transferasa), que puede eliminar el metilo introducido por
agentes alquilantes en la guanina (el cual daría lugar a transiciones G?A, pues la O
6
-
metilguanina se empareja con Timina).
2. La reparación por escisión de bases (BER) elimina las bases que han sufrido ataques
hidrolíticos (des-aminación, por ejemplo) por ROS o la 8-oxo-guanina producida por el
tabaco. El paso crítico en este tipo de reparación es la rotura del enlace N-glicosídico que
une la base al esqueleto desoxi-ribosa-fosfato, catalizado por ADN glicosilasas (específicas
para determinados tipos de lesión: UDG, OGG, etc). Posteriormente, el sitio AP (apurínico
ó apirimidínico) es roto por una AP endonucleasa que cataliza la incisión del enlace
fosfodiester en posición 5’ al sitio AP. La escisión del azúcar se completa con la
eliminación del residuo desoxi-ribosa-fosfato por la acción de una desoxi-ribosa-
fosfodiesterasa que corta el otro enlace fosfodiéster. Finalmente, se rellena el hueco
mediante la acción de ADN pol ß y una ADN ligasa. Este mecanismo de reparación parece
necesario para la viabilidad, ya que el ratón knock-out para ADN pol ß es letal embrionario.
Un proceso paralelo es crucial en la diversificación de los genes de las
inmunoglobulinas, ya que los linfocitos B expresan un enzima llamado AID (Activation-
Induced Deaminase) que desamina citosinas y las convierte en uracilos; dichos uracilos
crean sitios AP que pueden ser procesados por un complejo llamado RAD50 (que veremos
más adelante) que tienen una actividad liasa que rompe el esqueleto desoxi-ribosa-fosfato y
rompe el ADN. Dichas roturas son necesarias para que los genes de la inmunoglobulinas se
reordenen y puedan dar lugar a la diversidad necesaria para una adecuada respuesta
inmune.
Figura 3.5 Las lesiones que incluyen desemparejamientos con algún nucleótido
anormal o dañado son reparadas por el sistema de escisión de bases (BER). Como se
muestra en este video, en dicho sistema intervienen una glicosilasa, una endonucleasa,
una polimerasa y una ligasa.
3. La reparación por escisión de nucleótidos (NER) elimina fotoproductos producidos por
UV y otros aductos que confieren estructuras anormales a la cadena de ADN. El
mecanismo de actuación de este sistema de reparación no está totalmente claro, pero se
sabe que requiere la formación de un complejo entre XPC (proteína que es esencial para
NER) y RPA (proteína de unión a ADN monocatenario) con la región lesionada. Sobre este
foco también se unen XPA y el complejo TFIIH (que contiene, entre otras, las proteínas
XPB (ERCC3) y XPD (ERCC2), ambas con actividad helicasa necesaria para llevar a cabo
NER). El paso clave es la creación de dos incisiones, flanqueando la lesión, en la cadena de
ADN que está dañada: una incisión tiene lugar 3 a 9 bases en dirección 3’ de la lesión y la
otra incisión se produce 16 a 25 bases en dirección 5’ de la lesión, comprendiendo unas
25-30 bases en total. En mamíferos, la incisión 3’ la lleva a cabo una nucleasa llamada
XPG, y la incisión 5’ la realiza el heterodímero XPF/ERCC1. Tras las incisiones y
eliminación de la región dañada, tiene lugar la resíntesis de esa región mediante la acción
de un holoenzima que contiene PCNA y DNApol d o e .
Figura 3.6 Como muestra este video, el sistema de reparación por escisión de
nucleótidos (NER) incluye varios complejos multi-proteicos que eliminan los
nucleótidos flanqueantes a la lesión, de modo que el hueco es rellenado por
polimerasas especiales y sellado por una ligasa.
Un aspecto especialmente interesante es la relación del NER con la transcripción, a través
de la presencia de XPB y XPD en TFIIH (que es uno de los factores de transcripción
generales), dando lugar al concepto de Reparación acoplada a la transcripción
(TCR=Transcription-Coupled Repair). De hecho, se ha comprobado que el daño por UV
se repara con más eficacia y más rápido en la cadena que se transcribe y en genes
transcripcionalmente activos. También se ha visto que ciertos tipos de daño oxidativo
puede repararse por TCR incluso cuando el NER no funciona. Además de los citados XPB
y XPD, otras dos proteínas con actividad helicasa (CSA y CSB) son responsables de TCR,
y también se ha implicado a hMLH1 en TCR. Las mutaciones que destruyen el sistema
TCR dan lugar a una enfermedad llamada Síndrome de Cockayne. Las mutaciones en
genes que codifican otras proteínas asociadas con NER dan lugar a varias enfermedades
(Xeroderma pigmentosum, Tricotiodistrofia), que en su conjunto cursan con
fotosensibilidad e inestabilidad cromosómica, y aumento del riesgo de aparicion de
melanoma (un tipo de cáncer de piel). Finalmente, algunos pacientes tienen una variante de
Xeroderma Pigmentosum sin defectos en NER (llamada XP variante, ó XP-V), que está
debida a mutaciones en el gen humano homólogo del gen RAD30 de levadura. Este gen
codifica la polimerasa eta (Pol ), que puede replicar el ADN correctamente incluso en la
presencia de dímeros de pirimidinas.
4. Respecto al último mecanismo de reparación de nucleótidos dañados (es decir, las
polimerasas capaces de "saltarse" la lesión), recientemente se ha visto que Pol
(polimerasa zeta) ó Pol (polimerasa eta) son capaces de sintetizar ADN frente a dímeros
TT. Sin embargo, así como Pol suele introducir dos Adeninas, Pol introduce bases
incorrectas y por tanto es un mecanismo de reparación de baja fidelidad.
C. Reparación de roturas de la doble hebra del ADN.
La creación de roturas bicatenarias del ADN (DSB=Double-Strand Breaks) es un paso
necesario para la recombinación homóloga en meiosis y mitosis, y para la reordenación
V(D)J de genes de las inmunoglobulinas y receptores de células T. Además, este tipo de
roturas aparecen durante la replicación del ADN y también son causadas por diferentes
agentes genotóxicos: radiación ionizante (rayos X), ROS originados por el metabolismo
celular. Los DSB se reparan por dos vías principales, en diferentes fases del ciclo celular:
Fusión no homóloga de extremos (NHEJ), que funciona sobre todo en G1/S (antes de la
replicación del ADN) y Recombinación homóloga (HR), que teóricamente actuaría en
S/G2, cuando ya hay dos cromátides hermanas (de manera que se utiliza la doble hebra
homóloga como molde para la reparación).
Figura 3.7 El video muestra los efectos de una rotura bicatenaria del ADN (DSB)
sobre el metabolismo celular, y los mecanismos de control del ciclo y de reparación
que se ponen en marcha para evitar que dicha roture tenga graves consecuencias.
1. Recombinación Homóloga: como ya hemos comentado en el Capítulo 2, la maquinaria
responsable del mecanismo molecular de recombinación meiótica se utiliza también para
reparar DSB a partir de una cromátide hermana. El mecanismo general es bien conocido, e
incluye el procesamiento de los extremos mediante una exonucleasa 5' ? 3’ para dejar
extensiones 3’ libres, invasión de la doble hebra homóloga por parte del filamento de ADN
monocatenario recubierto de proteínas, síntesis de nuevo ADN usando la cadena homóloga
como molde, ligación y resolución de la recombinación. Da lugar a conversión génica con ó
sin sobrecruzamiento, según sea la resolución de las estructuras de Holliday).
RAD51 (homólogo del gen RecA, que en E. coli es fundamental en la respuesta SOS)
forma filamentos sobre el extremo monocatenario de ADN que resulta de la digestión
de los extremos libres, y es necesario para que se pueda realizar la invasión de la cadena
libre a la doble cadena homóloga. RAD51 es indetectable en G1 y se expresa en S/G2. Los
ratones RAD51
-/-
son letales embrionarios y sus células muestran inestabilidad
cromosómica. Una línea celular de pollo, en la que RAD51 está bajo el control de un
promotor represible, muestra inestabilidad cromosómica y muerte celular cuando se
reprime la expresión de RAD51, lo que refuerza la necesidad de este gen para la viabilidad
celular. Hay otros genes implicados en reparación de DSB que tienen cierta homología con
RAD51 y que podrían modular la acción de éste. Por ejemplo, se ha visto que la ausencia
del gen XRCC2 (20% de homología con Rad51) disminuye la eficacia de la recombinación
homóloga en la reparación de DSB, pero no es letal; lo mismo podría suceder con RAD55 o
RAD57. Por otra parte, se ha comprobado en levadura que la proteína RPA altera la
eficacia con la que se forman los filamentos de RAD51.
RAD52 parece actuar como el “portero” del mecanismo de recombinación homóloga. Esta
proteína interacciona con RPA y con RAD51, favoreciendo la formación del filamento de
RAD51 en presencia de RPA. Como el ratón RAD52
-/-
no es letal (sólo se observa una
ligara disminución en la eficacia de recombinación homóloga), se postula la existencia de
genes homólogos de RAD52 complementen la ausencia de éste.
La expresión del complejo RAD50 no varía durante el ciclo celular, por lo que debe
regularse post-traduccionalmente (mediante fosforilación o por compartimentalización en el
núcleo). Este complejo tiene actividad 5’?3’ exonucleasa, y parece transducir señales de
daño de ADN hacia la parada del ciclo celular. Experimentos de irradiación “en bandas”
han mostrado, mediante anticuerpos monoclonales contra un componente de este complejo,
que RAD50 se asocia a los DSB muy pronto tras la irradiación. En humanos, los pacientes
con el llamado "Síndrome de Roturas de Nimega" tienen mutaciones en un componente
de este complejo llamado NBS1, muestran sensibilidad a radiación ionizante e inestabilidad
cromosómica, y las células de estos pacientes no son capaces de formar focos después de la
irradiación con rayos X ultrablandos; por tanto, lo más probable es que la proteína NBS1
sea responsable de dirigir el complejo RAD50 a los lugares de daño del ADN.

Figura 3.8 La figura muestra inmunofluorescencias de un fibroblasto que ha sido
irradiado, utilizando anticuerpos frente a la histona H2AX fosforilada (en verde, a la
izquierda), o bien anticuerpos frente a la subunidad catalítica de ADN-PK (en rojo, en
el centro). La imagen de la derecha muestra la superposición de las otras dos
imágenes, apareciendo en amarillo los puntos en los que coincide una señal verde con
una roja. La imagen está tomada de la página del Lawrence Berkeley National
Laboratory en la universidad de California
La imagen demuestra que tras la irradiación (que genera muchas roturas bicatenarias en el
ADN) se crean unos focos de reparación donde se concentran las maquinarias encargadas
de llevar a cabo dicha reparación. Aunque en esta imagen se muestran moléculas que
intervienen en la reparación no homóloga de extremos libres, la utilización de anticuerpos
frente a componentes del sistema de reparación por recombinación homóloga (RAD51,
NBS, etc) da lugar a imágenes similares.
Una observación muy interesante es la implicación de BRCA1 y BRCA2 (genes mutados
en ciertos tipos de cáncer de mama familiar) con la reparación de DSB, ya que se ha visto
que las proteínas codificadas por estos genes interaccionan con RAD51, bien directamente
(BRCA2) o de manera indirecta (BRCA1). ambas son proteínas nucleares que se expresan
en S/G2, funcionan como activadores transcripcionales, y los ratones knock out de ambas
son letales embrionarios. En cambio, un ratón que lleva una copia de BRCA2 truncada
(BRCA2
tr/tr
) sufre linfomas del timo, alta inestabilidad cromosómica y estimulación de la
vía de señalización de p53. BRCA1 se fosforila tras daño al ADN, y se ha descrito la
asociación de BRCA1 con el complejo RAD50 en el momento del ciclo celular en que
BRCA1 está fosforilado (S/G2). Por otra parte, en estudios de co-localización tras
irradiación similares a los descritos arriba, se ha visto que BRCA1 está presente en focos
nucleares que contienen RAD50 en unas células o en focos que contienen RAD51 en
otras células, pero no hay células en las que se asocie con ambos a la vez. Una hipótesis
atractiva es que durante la reparación de DSB por recombinación homóloga BRCA1
coopera con RAD50 en el procesamiento de los extremos del ADN dañado y que, mediante
la interacción entre BRCA1 y BRCA2 (que se asocia físicamente a RAD51), facilita el
acoplamiento con los procesos de recombinación mediados por RAD51. En el año 2011 se
publicó otra propiedad muy interesante de BRCA1: es capaz de ubiquitinar la histona
H2A de la cromatina pericentromérica, manteniéndola así silenciada. La ausencia de
BRCA1 permite la transcripción del ADN satélite de esas regiones, lo cual conduce a la
formación de DSBs y fallos en la reparación por recombinación homóloga, aunque no se
sabe exactamente cómo se produce esto.
2. Fusión no homóloga de extremos (NHEJ): El proceso general de reparación es similar
pero sin recombinación, ya que en este caso no existe una doble cadena homóloga:
simplemente se fusionan los extremos libres. Tras la generación del DSB, los extremos
libres también son procesados por una nucleasa; posteriormente se procede a la unión de los
mismos y a la ligación, perdiéndose siempre algunas bases en la región de unión.
Este mecanismo tiene lugar fisiológicamente en linfocitos, donde es responsable de la
reordenación de segmentos V(D)J de los genes de inmunoglobulinas. Un componente
principal de este sistema es el complejo ADN-PK (DNAPK), una serina/treonina kinasa
nuclear que consta de una subunidad catalítica (DNAPKcs) y de un heterodímero de
unión a ADN llamado KU (que a su vez se compone de KU70 y KU80). El complejo
ADN-PK se asocia a los extremos rotos, ayuda al alineamiento de los extremos y facilita su
ligación. Este sistema de reparación es importante, sobre todo en células del sistema
inmune, y de hecho las mutaciones en el gen que codifica la DNAPKcs provocan la
enfermedad llamada Inmunodeficiencia Combinada Severa (SCID). Además, el complejo
ADN-PK fosforila y activa una nucleasa llamada Artemis, que es la responsable de llevar a
cabo el procesamiento de los extremos libres para que se puedan religar. Este último paso,
la unión de los extremos ya procesados, es realizado por una ligasa (ADN ligasa IV) que
actúa junto con XRCC4, una fosfoproteina nuclear que también es sustrato de ADN-PK in
vitro.
Figura 3.9 El mecanismo más utilizado en mamíferos para reparar las roturas
bicatenarias del ADN es la fusión no homóloga de extremos (NHEJ). En este video se
muestran los complejos proteicos implicados y su funcionamiento en dicho sistema.
Es muy interesante la asociación que se ha encontrado en levaduras entre Ku70 y proteínas
silenciadoras de la transcripción de telómeros (Sir2, Sir3 y Sir4), sugiriendo la posibilidad
de que Ku reclute proteínas Sir a los DSB para inducir un estado de cromatina
condensada que evite la transcripción o replicación y facilite el proceso de reparación, o
bien evite que los extremos libres de ADN puedan interaccionar con otras moléculas de
ADN. Dado que la disrupción de Ku o del complejo RAD50 lleva al acortamiento de
telómeros en levaduras, es lógico pensar que Ku se una al ADN telomérico e interaccione
con Sir4 para inhibir la replicación a ese nivel.
Tradicionalmente se ha considerado que el principal mecanismo de reparación de DSB en
mamíferos es la fusión de extremos (NHEJ), ya que se ha visto que la frecuencia de
recombinación homóloga en mitosis es muy baja. Esto es lo contrario de lo que sucede en
levaduras, donde el principal mecanismo de reparación de DSBs es la recombinación
homóloga. Actualmente, en cambio, esto está en discusión. Por un lado, parece que la
recombinación mitótica en mamíferos es más alta de lo que se creía: del orden de 10
-4 a 10-5
;
por otro lado, los ratones incapaces de llevar a cabo NHEJ (DNAPK -/-) no son letales,
mientras que los ratones incapaces de recombinación homóloga (RAD51-/- ó los RAD54-/-
) sí son letales. Esto indica que HR puede de alguna forma complementar la ausencia de
NHEJ, pero en cambio NHEJ no puede complementar la ausencia de HR en células
somáticas.
D. Mecanismos de reparación presentes en mitocondrias.
Un tema reciente en patología genética humana es la alteración de los mecanismos de
reparación del ADN mitocondrial. Tradicionalmente se ha considerado que las
mitocondrias de mamíferos no son capaces de llevar a cabo ningún tipo de reparación, ya
que los dímeros de pirimidinas no son reparados con eficacia. Esto explicaría además la
mayor tasa de mutaciones del ADN mitocondrial (ADNmt) respecto al ADN nuclear. Hoy
se sabe que hay ciertos tipos de daño que sí pueden repararse en mitocondrias (por ejemplo,
los sitios AP originados por daño oxidativo) y en general parece que las mitocondrias de
organismos superiores son capaces de llevar a cabo BER pero no NER ni MMR. El tipo
de daño que puede repararse mediante BER va a estar limitado por la presencia de ADN
glicosilasas en la mitocondria, y hasta el momento se ha demostrado la presencia de uracil-
ADN-glicosilasa (UDG) y de 8-oxo-guanina-glicosilasa (OGG). Además, otras glicosilasas
tienen señales de localización mitocondrial en sus extremos N-terminal. Una diferencia del
BER que se lleva a cabo en mitocondrias con el BER nuclear es que la polimerasa presente
en mitocondrias es la ADN pol ?, que además posee actividad liasa (fosfodiesterasa).
También existe dentro de la mitocondria una actividad ADN ligasa, que al parecer se
origina a partir del gen de la ADN ligasa I I I por un codón de iniciación alternativo
que crea una señal de localización mitocondrial.

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