Acid Citric-Acid Lactic

Hình 1: Cấu tạo của acid citric C6H8O7

1. GIỚI THIỆU VÀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN: Forter đã mở đầu quyển sách “ Hoạt động hóa học của nấm” bằng một tuyên bố: “ Có lẽ các nghiên cứu tập trung vào quá trình lên men acid citric còn nhiều hơn cả những nghiên cứu về các chức năng khác trong quá trình biến dưỡng ở nấm mốc, tuy vậy, những kiến thức cơ bản được quan tâm đến có lẽ ít hơn cả những qui trình được miêu tả trong quyển sách này – tuy nhiên nếu xét trong lịch sử nghiên cứu, lên men acid citric là qui trình về nấm đầu tiên có tiềm năng trong công nghiệp được khám phá.” Thực vậy, từ khi điều này được công bố thì số lượng các bài báo về chủ đề này tăng lên đáng kể và hi vọng rằng nó sẽ góp phần xứng đáng vào khối kiến thức về công nghệ và sinh hóa vi sinh vật. Năm 1891- 1893, lần đầu tiên sự tạo thành acid citric được quan sát thấy bởi Wehmer, nó được xem như là một sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất acid oxalic bằng cách nuôi cấy Penicillium glaucum trên môi trường có đường. Năm 1893, ông đã phân lập được hai chủng mới có khả năng tích lũy acid citric và cho rằng chúng là một chi mới. Cytromyces được xem như là chủng Penicillia đơn vòng (Wehmer, 1903). Những thử nghiệm của Fabrique de Produit Chimiques de Thann et the Mulhouse nhằm sản xuất tạo acid citric trên quy mô công nghiệp đã bị thất bại. Nguyên nhân dẫn đến thất bại là do quá trình lên men phải được tiến hành trong vài tuần thì mới thu được một sản lượng đáng kể vì vậy rất dễ bị tạp nhiễm. Đặc biệt là vì Wehmer tin vào những tuyên bố mang tính thuyết phục tại thời điểm đó rằng để tạo ra và duy trì sản phẩm acid thì acid tạo thành phải được trung hòa.

2

Năm 1913, Zanhorsky đã được cấp patent (bằng sáng chế có bảng quyền) cho quy trình sản xuất acid citric khi sử dụng Sterigmatocytis nigra – một tên gọi khác của cho Aspergillus niger. Tuy nhiên chính kết quả nghiên cứu của Currie mới mở ra con đường cho những thành công sau này của việc sản xuất acid citric ở quy mô công nghiệp. Năm 1916, J.N. Currie với vai trò là cộng sự của tiến sĩ Ch. Thom - người đứng đầu phòng thí nghiệm vi sinh ở Cục Hóa Học tại thành phố Washington.DC, lần đầu tiên quan sát thấy một số lượng lớn các chủng Aspergillus niger có trong phòng thí nghiệm có khả năng sản xuất một lượng đáng kể acid citric trong những điều kiện thuận lợi. Phát hiện được cho là quan trọng bậc nhất chính là Aspergillus niger phát triển rất tốt khi giá trị pH nằm trong khoảng từ 2,5 – 3,5 mà acid citric lại được tạo ra nhiều khi giá trị pH của môi trường ở mức thấp. Hơn thế nữa, điểm nổi bật của phát hiện này chính là với giá trị pH thấp như vậy thì sau từ 1-2 tuần có thể thu được gần 60% sản lượng trên môi trường tối thiểu với khả năng bị tạp nhiễm là rất thấp. Cho đến lúc này, tổng lượng dung dịch acid citric được tạo ra từ nước ép trái cây (chủ yếu là từ chanh) khoảng 10.000 t/a, trong đó hàm lượng acid citric nguyên chất chiếm 7-9% và tồn tại dưới dạng muối calcium. Để sản xuất ra 1 tấn acid citric cần khoảng 20 - 30 tấn chanh (tương đương với diện tích khoảng 2,7 ha). Lúc này, Italy là nước cung cấp hơn 80% nhu cầu về acid lactic của thế giới. Nhiều công ty ở các nước khác nhau đã tiến hành nhập từ muối calcium citrate đến acid citric chủ yếu là để cung cấp cho ngành công nghiệp sản xuất thức uống. Sau khi kết thúc chiến tranh thế giới thứ nhất cả nước xuất khẩu là Italy lẫn các nước nhập khẩu đều rơi vào hoàn cảnh tài chính kinh tế bị hạn chế, vì vậy hình thức sản xuất cũ không còn phù hợp, người ta tiến hành tìm kiếm những phương thức sản xuất acid citric mới. Chính lúc này, những phát hiện trước đây của Currie mới trở thành những công cụ quan trọng nhất cho sự phát triển của ngành công nghiệp sản xuất acid citric trên quy mô lớn bằng hình thức lên men. Việc Currie phát hiện ra rằng Aspergillus niger có thể phát triển và tích lũy acid citric tại pH < 2 cho ý nghĩa là “ khi quá trình lên men được bắt đầu ở nồng độ pH này thì khả năng của sự xâm nhiễm có thể được loại bỏ hoàn toàn”. Hơn nữa, ông đã tìm ra rằng nồng độ đường cao là điều kiện thuận lợi nhất cho tỉ lệ sản phẩm cao và ông đã quan sát thấy rằng sản lượng tối ưu chỉ có thể đạt được dưới điều kiện giới hạn phát triển. Năm 1919, những nỗ lực khác nhằm đưa hình thức lên men acid citric vào trong sản xuất thương mại đã bị thất bại (Societé des Produits Oganiques de Tirlemont, Bỉ), nhưng đến năm 1923, Chas. Pfizer & công ty tại New York, đã thành công khi áp dụng phương pháp của Currie và họ trở thành những người sản xuất acid citric lớn nhất thế giới. Sau đó, tại Anh, J và E. Sturge đã tiến hành sản xuất calci citrate theo quy trình theo quy trình tương tự dựa trên bản quyền sáng chế của Fernbach và cs. (1927- 1932). Năm 1928, một nhà máy sản xuất acid citric dựa trên nguồn carbon rẻ tiền là mật đường củ cải đã được xây dựng tại Kaznèjov gần Plzen, Cộng hòa Czech (Montan - und Industrialwerke, vorm. J.D. Stark, 1924; Szucs, 1925). Khó khăn khi sử dụng loại vật liệu này đó chính là sự hiện diện của các ion kim loại, trong đó đóng vai trò quyết định là các ion kim loại chuyển đổi. Theo Leopold và Valtr (1964) thì các nhà máy này cần sử dụng hexacyanoferrate (HCF) trong bước đầu tiên để tủa hoặc tạo phức hợp với các kim loại không mong muốn trong môi trường. Điều này được cất giữ bí mật và được công bố khá trễ vào năm 1938 với bằng sáng chế được cấp cho Mezzadroli (1938).

3

Nhiều nhà máy đã được xây dựng ngay sau đó ở nhiều nước như là Liên bang Soviet, Đức (Joh. A. Benekiser GmbH), Bỉ (La Citrique Belge) và ở một vài nước khác. Kể từ năm 1933 theo Perquin (1938) tổng lượng acid citric trên thế giới là 10.400 tấn với chỉ 1.800 tấn được sản xuất từ ở Italy, phần còn lại được sản xuất với quy mô lớn bằng công nghệ lên men ( Châu Âu: 5.100 tấn, Mỹ: 3.500 tấn). Rất nhiều tác giả đã tham gia nghiên cứu đã giúp làm sáng tỏ cơ chế sinh hóa của quá trình sản xuất acid citric như là Bernhauer (1940), Foster (1949), Prescott và Dunn (1959) hay Johnson (1954). Một câu hỏi khá thú vị được đặt ra: đã có bao nhiêu giả thuyết đã được đưa ra cho tới khi con đường sinh tổng hợp acid citric từ con đường phá vỡ carbohydrate thông thường được công bố và phản ứng nền tảng của chu trình tricarboxylic acid (TCA) – sự tích tụ acetyl CoA và oxaloacetate, đã được hiểu một cách rõ ràng. Tuy nhiên, cơ chế điều hòa dẫn đến sự tổng hợp acid citric với hàm lượng cao và sự bài tiết nhanh chóng chỉ mới được bắt đầu nghiên cứu từ thập niên 1970 và nó tiếp tục được nhiều nhóm nghiên cứu quan tâm. Ban đầu việc lên men acid citric được tiến hành theo hình thức nuôi cấy trên bề mặt. Sau này hình thức lên men chìm đã được đề nghị tuy nhiên hình thức này còn nảy sinh nhiều vấn đề chủ yếu là do điều kiện của hệ thống lên men và đặc biệt chủng sản xuất nhạy cảm với nhiều yếu tố mà cho đến nay vẫn chưa được nhận thức rõ. Tác động của các ion kim loại chuyển đổi đã được công bố nhiều hơn và điều đó là cần thiết để lựa chọn các loại vật liệu thô phù hợp. Trong suốt thập niên 1950 tỉ lệ của các phức chất cơ bản trong quá trình lên men đã được tuyên bố. Chỉ với hình thức lên men này mà đã có rất nhiều chiến lược đặc biệt được phát triển tương ứng với các loại vật liệu thô. Năm 1944, Szucs đã đưa quy trình hoạt động chia thành 2 giai đoạn chính: giai đoạn đầu kích thích sự phát triển của hệ nấm sợi, giai đoạn sau giới hạn sự phát triển tạo acid citric. Để đạt được điều này cần cung cấp một lượng đủ phospho (~ 70mg/l) vào trong môi trường ở giai đoạn phát triển và chuẩn bị một lượng phospho tự do trong môi trường ở giai đoạn sản xuất sản phẩm. Năm 1948 - 1949, Shu và Johnson đã cải tiến môi trường lên men để có thể tiến hành cả hai giai đoạn trong cùng một hệ thống. Các tác giả này đã chỉ ra rằng điều kiện tối ưu của quá trình lên men đòi hỏi phải có sự cân bằng giữa mangan, kẽm, phospho. Trong lên men thương mại việc bổ sung các nhân tố cần thiết là rất khó khăn vì quy trình này sử dụng các vật liệu thô có thành phần không được xác định rõ ràng (ví dụ mật rỉ đường). Rất nhiều công trình nghiên cứu được thực hiện để tìm kiếm điều kiện tối ưu khi sử dụng các loại cơ chất rẻ tiền như là mật rỉ đường (Shu, 1947; Karow và Waskman, 1947; Woodward và cs., 1949; Moyer, 1953), tinh bột (Moyer, 1953a, b), tinh bột đã được thủy phân (Schweiger và Snell, 1949). Có rất nhiều quy trình xử lí và tinh sạch mật đường đặc biệt là việc loại bỏ các kim loại vết. Hầu hết chúng đều được xử lí bằng HCF đầu tiên, hiện nay người ta đã đề nghị việc sử dụng các hạt trao đổi ion (Perlman và cs.,1945 Woodward và cs.,1949 .). Tuy nhiên hầu hết các thí nghiệm đã chỉ ra rằng HCF vừa đóng vai trò là chất loại bỏ ion, vừa đóng vai trò là chất đồng ức chế sự phát triển để có thể tích tụ được nhiều acid . Một bước đột phá chính đã đạt được tại Mỹ bởi những người người nghiên cứu của tập đoàn Miles Laboratories. Trong quá trình phát triển kĩ thuật các tác giả đã giới thiệu phương pháp sử dụng tinh bột đã được thủy phân như là một loại cơ chất rẻ tiền. Khi nghiên cứu với những vật liệu thô tinh khiết hơn, họ đã phát hiện ra rằng hoạt động bất lợi của các kim loại vết, có thể bị bất hoạt nếu thêm vào một lượng vừa đủ ion đồng

4

(Schweiger 1959,1961). Hơn thế nữa, tương tự HCF, nếu ion đồng được thêm vào vượt quá một lượng nhỏ thì sẽ rất thuận lợi cho việc sản xuất acid với sản lượng cao. Hoàn cảnh hiện tại: nhiều công ty đã sử dung những thành tựu kĩ thuật của lên men chìm và đã sản xuất khoảng 80% lượng acid citric trên thế giới. Chỉ một vài công ty vẫn còn tiếp tục sử dụng phương pháp nuôi cấy bề mặt truyền thống .

5

Hình 2: Con đường chuyển hoá đơn giản trong sản xuất acid citric từ carbohydrate và n-alkan

6

Vào thập niên 1960 một quy trình mới đã được đề ra trong khi nghiên cứu mở rộng trên việc sử dụng n-alkan như là một nguồn carbon cho quá trình sản xuất sinh khối vi sinh vật (protein đơn bào, SCP) và những sản phẩm khác như acid amino, vitamin, acid hữu cơ .v.v…. Các nhà nghiên cứu tại Nhật Bản là những người đầu tiên sử dụng các chủng vi khuẩn Corynephom đột biến thay cho Corinebaterium, Arthobater và Brevibacterium trong công nghệ lên men ngay sau đó đã trở thành một công nghệ được thiết lập với những đặc tính tiêu biểu của những thành tựu trí tuệ. Năm 1966 - 1967 một vài chủng đột biến đã được tạo ra để sản xuất acid citric từ n-parafins (C9-C30 )và các cơ chất liên quan. Mặc dù nó đã được đăng kí bản quyền (Tanaka và cs., 1968), tuy nhiên nó không được khai thác trên quy mô công nghiêp. Sau đó người ta đã phát hiện ra rằng nấm men, chủng Candida và các dạng liên quan đã sử dụng n-alkan làm nguồn carbon cho nguồn sản xuất sinh khối đồng thời nó cũng có thể sản xuất ra một lượng lớn acid citric từ nparafins sản phẩm có trộn lẫn (isocitric acid) (Fukui và Tanaka,1980). Những nỗ lực để cô lập acid citric như là một sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất SCP sớm được thay thế bằng việc đầu tư nghiên cứu sản xuất acid citric như là một sản phẩm chính. Điều này cũng do việc sản xuất SCP từ nguồn hydrocarbon không được chấp nhận vì những ảnh hưởng của nó đến sức khỏe vật nuôi. Mặc dù sản lượng acid citric tạo ra từ các alkan từ C9 – C20 trong phòng thí nghiệm đạt hiệu suất 100% nhưng việc đưa vào sản xuất công nghiệp vẫn bị hạn chế bởi một vài lí do: việc sản xuất acid citric từ cơ chất này luôn kèm theo một lượng lớn isocitric acid mà sự có của chất này không được chấp nhận trong nhiều ứng dụng, ví dụ trong sản xuất thức ăn công nghiệp; việc chọn dòng và xác định các thông số tối ưu của quá trình cần được xem xét. Trong thời gian chờ đợi thì rõ ràng nó không phải là một cơ chất rẻ để tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid citric. Cho dù như thế nào thì việc nghiên cứu lại ứng dụng của nấm men hoặc vi khuẩn cũng đem lại nhiều hiệu quả thú vị. Đặc biệt trong thời kỳ của việc sản xuất acid citric như là một sản phẩm phụ của sản xuất SCP. Việc này cần thiết để thúc đẩy các quy trình cô lập dung dịch acid citric. Phương pháp li trích bằng dung môi đã được phát triển và ngày nay được ứng dụng phổ biến trong hoạt động lên men truyền thống. Mặt khác, người ta cũng quan sát thấy rằng có những chủng nấm men có thể sản xuất được acid citric khi phát triển trên môi trường có chứa glucose hay các nguồn carbon tương tự (Tabuchi và cs., 1969; Abe và cs., 1970). Những kết quả tìm ra đã được nghiên cứu mở rộng và phát triển xa hơn trong nước CHDC Đức. Những liên kết với người Đức có lẽ đã hạn chế các nổ lực tiến xa hơn để đưa các kỹ thuật mới vào sản xuất trên quy mô lớn. 2.CƠ SỞ SINH HÓA – SỰ ĐIỀU HOÀ TÍCH LUỸ ACID CITRIC 2.1 Loại và nồng độ đường để khởi động con đường tích lũy acid citric không thông qua sự điều hòa Glycolytic Có nhiều thông số ảnh hưởng đến hiệu quả tích lũy acid citric khi sử dụng Asp. niger. Trong số đó loại và nồng độ đường là yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất. Trong khi nồng độ tối ưu của các kim loại vết phosphate và nitrogen có mối tương quan với nhau thì nồng độ và loại đường được xem như là một thông số độc lập. Sự thích hợp của các nguồn carbon khác nhau trong sản xuất acid citric bằng Asp. niger đã được đưa ra thảo luận bởi Xu và cs (1989b): chỉ những nguồn carbon như glucose và sucrose mới được

7

nấm chuyển hóa nhanh chóng cho kết quả sản lượng và tỉ lệ acid được tích lũy cao. Nền tảng sinh hóa của tác động này khi không thông qua sự điều hòa glycolytic: có ít nhất 3 enzyme trong con đường chuyển hóa hexose biphosphate của Aspergilli kiểm soát phần lớn quá trình đó là hexokinase (EC 2.7.7.1), 6-phosphofructokinase (EC 2.7.7.11; PFK 1), và pyruvate kinase (EC 2.7.1.40) (Smitt và NG, 1972; Kubicek, 1988b). Cần chú ý rằng cơ chế điều hòa biến dưỡng tốt là nguyên nhân của sự điều hòa glycolytic tức là khi gia tăng hoạt tính của một vài enzyme glycolytic thì không dẫn đến sự gia tăng lượng acid citric tạo ra. Sự khuếch đại gen ví dụ pki A (gen mã hóa pyruvate kinase) không dẫn đến sự cải tiến của chủng sản xuất (l. De Graaff, J.Visser, S. Choojun, M. Roehr và C. P. Kubicek, kết quả này chưa được công bố). Tương tự, sự điều hòa glycolytic ở nấm men không bị tác động bởi sự khuếch đại các gen chọn lọc (Heinisch, 1986).

Hình 3: Quy trình chuyển hoá của acid citric Đặc điểm của PFK1 trong A. niger đã được hiểu rõ hoàn toàn và rất nhạy cảm trong kiểm soát nhiều con đường biến đưỡng khác nhau như là được hoạt hóa bởi Fru2,6-P2 AMP, ion NH4+ và bị ức chế bởi phosphoenol Pyruvate, citrat và ATP (Habison và cs., 1983; Arts và cs., 1987). Đã có những bằng chứng gián tiếp về sự điều hòa protein 8

kinase dựa vào c-AMP (Legisa và Bencina, 1994). Sự hoạt hóa bởi Fru-2,6-P 2 kết nối các PFK1 với nhau và điều hòa 6-phosphofructose-2-kinase (EC 2.7.1.105; PFK2). Nó kích thích sự tò mò rằng enzyme sau điều hòa kém trong A.niger. Và kết quả đã chỉ ra rằng hoạt động của enzyme này được biến đổi chính do sự gắn Fru-6-P lên bề mặt (Harmsen và cs., 1992). Vì vậy sự chuyển đổi của Fru-6-P thành Fru-1,6-P được xem như là một điểm quan trọng trong sự điều hòa dòng chảy glycolytic. Theo một báo cáo cho rằng sự tích lũy acid citric chỉ có thể xuất hiện dưới điều kiện PFK1 không thể kiểm soát dòng chảy glycolytic một cách hiệu quả. Sự trung hòa vai trò của NH+4 - tích lũy dưới điều kiện Mn (Kubicek và cs., 1979a) - sự ức chế citrate của PFK1 là một thông số liên quan trong quá trình này (Habison và cs., 1979,1983). Tuy nhiên sự tích lũy acid bởi nồng độ đường cao lại lên quan tới một con đường biến dưỡng khác: nồng độ đường cao làm gia tăng nồng độ Fru-2,6-P 2 nội bào (Kubicek – Pranz và cs., 1990). Đây chỉ là một quan sát với nguồn carbon cho sản lượng acid citric cao. Vì nồng độ Fru-6-P nội bào chỉ cao dưới một vài điều kiện, nghiên cứu tạm thời cho thấy rằng nó phụ thuộc loại nguồn carbon và nồng độ acid citric tích lũy vì sự khác nhau của chúng ảnh hưởng đến nồng độ Fru-6-P ở trạng thái bền mà điều đó ảnh hưởng đến sự thành lập các nhân tố Fru-2,6-P2 hoạt hóa glycolytic. Tuy nhiên, người ta đã đề ra một giả thuyết mà nếu đúng nó sẽ gợi ra các bước biến dưỡng trước khi tạo thành Fru-6-P nghĩa là hexokinase (phosphoglucose isomerase xúc tác phản ứng cân bằng nhanh chóng và không nằm trong những chất điều hòa quan trọng) có lẽ đã tham gia vào trong việc điều hòa phản ứng thủy phân glucose và tích lũy acid citric dưới những điều kiện phù hợp. Bằng việc sử dụng phương pháp phân tích độ nhạy của trạng thái bền, Torres (1994a,b) đã cho rằng hoặc có sự chuyển đổi hoặc phosphoryl hóa glucose đã đẩy mạnh quá trình tích lũy acid citric. Đặc điểm sinh hóa của quá trình phosphoryl hóa hexose trong Asp. niger đã được nghiên cứu kỹ (Steinbock và cs., 1993): không giống như S. cerevisiae (Lobo và Mattra 1977) nhưng nó lại tương thích với chủng Khuyveromyces lactis (Prior và cs., 1993), Asp. niger chỉ chứa một loại hexokinase. Enzyme này được tạo ra khi nồng độ sucrose hay glucose ở mức cao. Đặc điểm động học của nó gần giống như enzyme của động vật, nghĩa là nó không bị ức chế bởi glucose-6-phosphate. Việc sử dụng chủng A.niger đột biến kháng 2-deoxyglucose trong sản xuất acid citric đã được loại bỏ (Fledurek và cs., 1988; Kirimura và cs., 1992) vì nó đã khử hoạt tính của hexokinase. Đồ thị hoạt động của hexokinase chống lại sự tích lũy citrate trong chủng đột biến đã được đề nghị rằng hexokinase không bị giới hạn trong dòng biến dưỡng. Phát hiện này cho rằng việc khử hoạt tính của hexokinase có thể là hệ quả của dòng chảy carbon ở tỉ lệ thấp trong chủng đột biến kháng desoxyglucose. Như vậy hầu như các nhân tố kiểm soát hiệu quả các bước chuyển hóa sớm của glucose đã được khám phá 2.2 Pyruvate carboxylase và vai trò của sự phân ngăn chuyển hoá Độc lập với quá trình điều hòa sản phẩm cuối cùng của quá trình glyco giải hiếu khí là pyruvate. Trong tế bào bình thường các sản phẩm của quá trình dị hóa pyruvate đi vào trong ti thể và được chuyển hóa thành acetyl-coA. Asp. niger và một vài loại nấm khác có chứa pyruvate và carboxylase có khả năng biến đổi pyruvate và CO2 tạo thành oxaloacetat (Osmani và Schutton, 1983; Bercovitz và cs., 1990; Jaklitsch và cs., 1991). Enzyme này được cảm ứng khi nồng độ carbon hydrat hiện diện cao (Feir và Suzuki 1969; Hossain và cs., 1984). Sự liên quan của pyruvate carboxylase trong quá trình hình

9

thành acid citric đã được chứng minh bằng các thí nghiệm với chất được đánh dấu (Cleland và Johnson, 1954) và việc đo lương lượng khí thoát ra từ quá trình lên men (Kubicek và cs., 1979b). Điểm khác biệt lớn nhất giữa pyruvate carboxylase của nấm với hầu hết các sinh vật có nhân chính là vị trí của nó trong tế bào: hầu hết các enzyme của sinh vật có nhân được chứa trong ty thể (Osmani và Scrutton, 1983; Turohtt và Ratledge, 1988) còn trong Arpergillus spp. nó xuất hiện tại các vị trí chuyên biệt trong các phần cytosolic (Jaklitsch và cs., 1991) đây chính là điểm thuận lợi cơ bản nhất trong quá trình tích lũy acid: oxaloacetat không cần chuyển ra từ ti thể vì vậy nó sẽ không bị khử thành malate. Vì chất mang tricarboxylate sử dụng dicarboxylic acid như một đồng cơ chất. Kết quả có trong sự tạo thành citrate và malate. Hoạt động của citosolic pyruvate carboxylase đã kết nối quá trình glyco giải đến sự tạo thành citrat từ ti thể. 2.3.Hoạt động của chu trình Tricarboxilic Acid (TCA) và sự tích lũy acid citric Hầu hết những nghiên cứu trước đây về sự tích lũy acid citric đều tập trung vào sự ức chế của một bước trong chu trình TCA và chứa những điểm mâu thuẫn với nhau. Hầu hết các nhà nghiên cứu đều cho rằng nhất thiết phải có một bước ức chế trong chu trình tích lũy acid hữu cơ, trong khi đó một số khác - sử dụng các ti thể độc lập - lại cung cấp bằng chứng cho thấy sự hiện diện của một chu trình bình thường (để xem xét lại xem Roehr và cs., 1992; Kubicek và Roehr, 1986; Kubicek và cs., 1994). Không ai dám chắc rằng có hay không sự gia tăng nồng độ citrate là cần thiết cho sự tích lũy acid citric nhưng nó có thể xuất hiện như là một sản phẩm của đặc tính điều hòa các enzyme trong chu trình TCA. Trong khi có những bằng chứng cho thấy rằng aconitase không bị ức chế khi lượng citrate tạo ra quá nhiều (Rubicek và Roehr, 1985), điều này không thể được loại trừ đối với một vài enzyme khác trong chu trình TCA. Vì citrate ức chế NADP - đặc hiệu cho isocitrate dehydrogenase ( Mattey, 1977; Legisa và Mattey, 1986), tỉ lệ khử điện tử trong biến dưỡng [NADH/(NAD + NADH] ức chế NAD - đặc hiệu cho isocitrate dehydrogenase (Kubicek, 1988a), oxaloacetate, cisaconitate, NADH ức chế 2oxoglutarate dehydrogenase (Meixner Monori và cs., 1985). Tuy nhiên điều quan trọng đối với sự ức chế chính nếu chúng xuất hiện trong in vivo thì chưa được hiểu rõ: vì dòng ra của citrate phụ thuộc vào dòng vào malate, nguyên nhân cơ chế này đã được vạch ra bởi sự tích lũy citrate là độc lập bởi sự gia tăng vận chuyển trong tế bào chất. Thật không may, đặc tính của chất mang tricarboxylase của Asp. niger, ti thể vẫn chưa được nghiên cứu. Người ta vẫn tiếp tục quan tâm cao độ đến điều này bởi vì nó giúp giải thích tại sao isocitrate và cis aconitate – mặc dù có sự cân bằng của aconitase vẫn không được tích lũy bởi Asp. niger. Cần phải chú ý rằng phương pháp phân tích độ nhạy cảm của trạng thái bền cho thấy sự quan trọng của sự tuôn trào citrate trong ti thể đối với tỉ lệ tích lũy citrate (Torres, 1994b). 2.4 Sự điều hòa quá trình hình thành sản phẩm trong các điều kiện môi trường khác nhau: Bên cạnh các yếu tố như nồng độ và loại đường ảnh hưởng đến sự tích lũy citrate (đã được nói ở phần trên) thì các thông số môi trường khác cũng ảnh hưởng đến sự hình thành acid citric đi kèm với sự hình thành một số sản phẩm phụ khác như là gluconic acid và oxalic acid.

10

Điều kiện môi trường tối ưu cho sự tích lũy acid citric là: - Nồng độ đường cao: 120 – 250 g/l - Sự thiếu hụt các kim loại vết đặc biệt là Mn2+ và Fe3+. - Áp suất oxy hòa tan cao (> 140 mbar) - pH: 1.6-2.2 - Nồng độ phosphate được điều chỉnh ở mức tối thiểu cho yêu cầu phát triển. - Làm tăng nồng độ NH4+ Cơ sở sinh hoá về sự tác động của chúng sẽ được đề cập ở phần dưới. 2.4.1 Những ion kim loại vết: Rất nhiều kim loại vết có giá trị đặc biệt là Mn2+, tuy nhiên trong sự tích lũy acid bởi A. niger thì chỉ Fe3+ và Zn2+ đóng vai trò quan trọng, sự thiếu hụt Mn2+ là bắt buộc để thu được sản lượng cao. Có nhiều cách giải thích đã được đề nghị quan tâm đến đặc điểm sinh hóa trong hoạt động của kim loại vết (Roehr và cs., 1992). Vai trò của sự thiếu hụt mangan có lẽ tập trung làm giảm sự tổng hơp các đại phân tử (Kubicek và cs., 1979a; Hockertz và cs., 1989) do đó cảm ứng gia tăng protein biến tính (Kubicek và cs., 1979a; Ma và cs., 1985). Sự gia tăng nồng độ NH4+ tích lũy trong sợi nấm đã hoạt hóa PFK1, mà sự ức chế của nó được trung hòa bởi citrate nhờ đó thúc đẩy sự glyco giải (Kubicek và cs., 1979a). Giả thuyết được đưa ra cho chủng A. niger đột biến khi PFK1 nhạy cảm với nồng độ citrate đồng thời làm giảm sự nhạy cảm của sự tích lũy acid citric bởi Mn2+ (Schreferl và cs., 1986). Sự giảm sút trong quá trình tổng hợp các đại phân tử được cho là sự ức chế của ribonucleotide reductase, dẫn đến sự giảm sút trong việc tổng hợp DNA do thiếu tiền chất monomeric của sự nhân đôi DNA (Hockert và cs., 1988, 1989). Một vài tác động khác của sự thiếu hụt DNA như là ảnh hưởng lên sinh tổng hợp vách tế bào và hình thái học hyphal, mối liên hệ của sự rối loạn trong nhân đôi DNA chưa được làm rõ (Kubicek và Roehr, 1986). Tác động sau cùng là yếu tố nổi bật nhất và có thể được sử dụng như là tiêu chuẩn để dự đoán sự thành công của quá trình lên men acid citric: sự thiếu hụt mangan trên sợi nấm phát triển có không bào mạnh, phân nhánh cao, vách tế bào được làm đặc, xuất hiện những chỗ phình. Hiện tượng này có thể liên quan đến sự định hướng phát triển ngọn bởi sự mất định hướng vận chuyển các túi. Khả năng nổi bật của Cu2+ là trung hòa những tác động có hại của sự xuất hiện Mn2+ bởi vì nó có khả năng ức chế Mn2+ bằng cách hấp thu, sự xuất hiện của nó là đặc hiệu trong hệ thống vận chuyển có ái lực cao (Seehaus và cs., 1990). Ảnh hưởng của các kim loại khác trong sự tích lũy acid citric hữu cơ bởi Aspergilli hiện nay vẫn chưa được rõ ràng: một vài nhà nghiên cứu cho rằng Fe3+ có ảnh hưởng to lớn nhưng quan điểm này bị bác bỏ bởi nhiều người khác (Kubicek và Roehr, 1986). Trong quan điểm nồng độ cao của Fe3+ cần thiết để tích lũy citrate, các tác giả này công nhận rằng tạp chất mangan có thể thật sự ảnh hưởng đến kết quả quan sát được (Kubicek và Roehr, 1986). 2.4.2 Áp lực oxy hòa tan và sự thông khí: Sự hình thành tất cả các acid hữu cơ đều tăng dưới điều kiện thông khí mạnh. Sự hấp thu oxy với hàm lượng cao là cần thiết để cân bằng chuyển hóa giữa sự thành lập citrate với việc sử dụng hàm lượng đường cao. Điều này xuất hiện khi khả năng chuỗi hô hấp của A. niger không tạo thành NADH với tỉ lệ cao. Hơn thế nữa, sự gắn kết của phức hợp 1 từ chuỗi hô hấp ( NADH: ubiquinone reductase) trở nên rối loạn trong điều kiện

11

tích lũy acid citric (Wallrath và cs., 1991; Schmidt và cs., 1992). Trạng thái này được bù đắp bởi sự hoạt hóa một con đường hô hấp khác mà trong đó sự tái oxy hóa NADH thì không được kết hợp để tạo ATP (Zehentgruber và cs., 1987). Các thành phần không xác định của con đường phải phụ thuộc vào sự duy trì áp lực cao của oxy vì một sự gián đoạn ngắn có thể làm giảm hoạt động của nó ( Kubicek và cs., 1980). Những nỗ lực nghiên cứu cơ chế quan trọng này để giúp tránh khỏi sự dư thừa ATP mà không thể sử dụng trong phản ứng sinh tổng hợp. 2.4.3 pH: Sự tích lũy acid citric bởi Asp. niger chịu ảnh hưởng của pH tức là acid citric chỉ xuất hiện khi giá trị pH<2,5. Ở giá trị pH cao hơn thì oxalic acid và gluconic acid được tạo ra như một sản phẩm phụ. Giá trị pH bên ngoài chỉ ảnh hưởng rất nhỏ đến pH của cytosolic (Legisa và Kidric, 1989). Không ai chắc rằng sự thay đổi pH nhỏ chính là nguyên nhân làm bất hoạt các enzyme nội bào nhưng nó có thể ảnh hưởng đến quá trình điều hòa: một vài enzyme đã được chứng minh rằng đặc điểm điều hòa và động học thay đổi khi pH thay đổi chỉ một đơn vị (Banuelos và cs., 1977). Trong khi sự tạo thành gluconic acid khi giá trị pH ngoại bào cao có thể dễ dàng được giải thích bởi tác động của pH tới độ bền của glucose oxidase ngoại bào thì sự tích lũy acid oxalic tiếp tục được giải thích. Nghiên cứu sinh hóa sử dụng 14C đánh dấu cho thấy oxalate có nguồn gốc từ oxaloacetate và oxaloacetate hydrolase tại các vị trí chuyên biệt trong tế bào chất (Kubicek và cs., 1988). Enzyme này cạnh tranh với malate dehydrogenase cho sản phẩm của phản ứng là pyruvate carboxylase và mối quan hệ của 2 enzyme in vivo này quyết định loại acid được tạo thành. Oxaloacetate hydrolase được cảm ứng đặc hiệu bởi sự gia tăng nồng độ pH môi trường lên ít nhất là 5 khi có sự hiện diên của nitrogen và phosphate (Kubicek và cs., 1988). Tuy nhiên, hoạt động của cytosolic malate dehydrogenase isoenzyme phụ thuộc vào tỉ lệ cytosolic NADH/NAD, sự hình thành oxalic acid bị ảnh hưởng bởi hiệu quả của sự tái oxy hóa NADH. Một tác động khác của pH cũng đã được làm rõ (Roehr và cs., 1992): sự dư thừa một ATP và 3NADH xuất hiện khi quá trình tích lũy acid citric được diễn ra dưới điều kiện có sự chuyển đổi cân bằng giữa phân tử glucose thành citrate trong bước cuối của quá trình lên men acid citric (Roehr và cs., 1981), điều này là cần thiết để duy trì gradient pH giữa cytosol với môi trường ngoại bào. Mattey và cs. (1988) đã thiết lập được sự liên quan giữa sự gia tăng của ATPase trên màng tế bào với sự duy trì gradient pH trong sản xuất acid citric ở Asp. niger. Các tác giả này đã có một ý tưởng thú vị đó là giá trị pH thấp là yêu cầu của quá trình sinh tổng hợp acid citric, nó đóng vai trò như là van để làm dư ATP, mà nói theo cách khác nó sẽ dẫn đường cho sự chuyển hóa không cân bằng và sẽ dừng sự nhiễm acid. Sự cảm ứng của quá trình sinh tổng hợp oxalic acid tại giá trị pH ngoại bào cao phù hợp với giả thuyết này vì sự tạo thành oxalic acid chỉ xảy ra khi thừa ATP hay NADH. Tuy nhiên, giả thuyết này chưa có đủ bằng chứng thực nghiệm. 2.4.4 Ảnh hưởng của phospho và nitrogen: Nồng độ của cả phospho và nitrogen đều có ảnh hưởng trong môi trường tối ưu dùng để sản xuất acid hữu cơ bởi Aspergilli. Nhưng chỉ khi tích lũy acid trong nuôi cấy mẻ thì sự cân bằng của N, P và kim loại vết mới đóng vai trò quan trọng (Shu và Johnson, 1948b). Nền tảng sinh hóa cơ bản của những quan sát được biết đến rất ít: Dawson và cs. (1989) đã sử dụng hình thức lên men fed-batch như là một thí nghiệm

12

khẳng định rằng việc ngăn chặn sự chuyển hóa nitrogen là yếu tố điều hòa sự sản xuất acid citric. Tuy nhiên, kiến thức di truyền phân tử có thể được dùng trên các loại domain mở rộng trong A. nidulans (Caddick, 1992), khẳng định này cần được xác nhận di truyền. 3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT: Từ khi kiến thức về acid citric được công bố lần đầu tiên trên sách Biotechnology (Roehr và cs., 1983) thì kĩ thuật sản xuất acid citric đã được nghiên cứu lại bởi một vài tác giả như Bigelis (1985), Milsom và Meers (1985), Milsom (1987), Verhoef (1986), Kubicek và Roehr (1992), Bigelis và Arora (1992), Smith (1994), Noyes (1969) đã cung cấp thêm những kiến thức hữu ích và toàn diện về những bản báo cáo đã được cấp bằng sáng chế trong suốt giai đoạn từ 1944 - 1968 (xem Lawrence, 1974). 3.1 Giống sản xuất : Về cơ bản sự lựa chọn giống khởi đầu bằng sự phân lập giống từ môi trường tự nhiên theo phương pháp vi sinh thông thường. Nhiều chủng họp thành bộ sưu tập các chủng công nghiệp và các chủng được sự quản lý của chính phủ. Hầu hết các nhà vi sinh đều biết rằng Asp. niger có thể được làm giàu từ mẫu đất ẩm chứa khoảng 20% tannin được xem là nguồn C chính và tiến hành ủ từ 2-3 tuần (Rippel và Baldes, 1940). Vì Asp. niger sở hữu những enzyme cần thiết cho việc sử dụng tanninmột đặc tính mà chỉ được sử dụng trong nền công nghiệp cũ - làm giàu môi trường nuôi cấy với cơ Hình 4: Tạo dòng bào tử A.niger chất này thường thu được kết quả là chủng Asp. niger hoang dại, thuần chủng. Sau khi áp dụng kĩ thuật nuôi cấy thuần chủng, việc sản xuất chủng chọn có thể được tiến hành theo quy tắc sau: - Trong một quần thể hợp tử nấm, chỉ có một vài bào tử có đặc tính sản xuất mạnh mẽ được tách ra. - Có 2 phương pháp để chọn lọc: phương pháp chọn lọc bào tử đơn và phương pháp cấy chuyền. *Kỹ thuật bào tử đơn: Nuôi cấy một số lượng lớn những bào tử đơn chỉ định đã được pha loãng với nồng độ thích hợp. Bào tử từ những môi trường ví dụ từ lọ hay ống thuỷ tinh chứa môi trường chuẩn về nguồn C, có thể dùng mật rỉ đường làm nguồn carbon, được dùng để cấy chuyền. Thí nghiệm này có thể được tiến hành khi nuôi cấy bề mặt hay lọ, ống thuỷ tinh có khuấy trộn, chuẩn độ lượng acid tạo thành theo thời gian. Nhằm đạt kết quả một bào tử đính của Asp. niger sẽ tạo ra khoảng 10.000 bào tử, có thể cấy chuyền để thu được kết quả cao hơn. Trong sản xuất, các giống có hiệu suất tổng hợp cao thường bị thoái hoá sau một vài chu kỳ tái sử dụng. Do đó, trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn, cần có biện pháp chống lại hiện tượng thoái hoá, nghĩa là thay đổi khả năng sinh acid citric theo thời gian lưu lại, nhân giống hay là môi trường nuôi cấy.

13

Nhiều thử nghiệm để tìm ra những kĩ thuật chọn giống dễ dàng hơn đã được vạch ra. Phương pháp của James và cs. (1956) bằng cách cải thiện thử nghiệm trước đây của Davis (1948), Quilico và cs. (1949), bao gồm việc tạo ra một số lượng lớn các bào tử được nuôi cấy đơn trong đĩa petri sử dụng đĩa giấy lọc được làm ẩm với môi trường. Đồng thời có chất chỉ thị pH để phát hiện vùng acid được tạo thành trong quá trình phát triển của sợi nấm. Tuy nhiên, phương pháp này còn phụ thuộc vào các chất dinh dưỡng vô cơ thêm vào; phương pháp này có thể biểu hiện sự acid hóa khi sử dụng các muối sinh lý (ví dụ amoni sulphate) dẫn đến kết quả sai lầm, điều này được phát hiện bởi Bonatelli và Azevedo (1982). Sự sai lầm này có thể tránh nếu lựa chọn các muối bổ sung và chất chỉ thị thích hợp (Amirimani và Roehr, kết quả này chưa được công bố) hay sử dụng các loại thuốc thử đặc hiệu (p- dimethylaminobenzaldehyde) để phát hiện sự tạo thành acid citric (Roehr và cs., 1979). Một vài ví dụ về các chủng được lựa chọn dựa trên kỹ thuật bào tử đơn: chủng Wisconsin 72 (ATCC 1015), chủng bố mẹ Wisconsin 72- 4 (ATCC 11414) được phát hiện bởi nhóm Wisconsin (Perlman, 1949; Shu và Johnson, 1948a,b) và những nhóm nghiên cứu người Canada (Martin và Waters, 1952; Clark và cs., 1966). Tại Châu Âu, chủng đầu tiên sử dụng trong công nghiệp được sản xuất tại Viena (Szucs, 1925; Bernhaur, 1928) và Prague (Bernhaur, 1928). Các chủng tìm thấy được áp dụng tại các nhà máy của Kaznejov gần Plzen, Cộng hòa Séc; tại Bernekiser GmbH, Ladenburg, Đức và Citrique Belge, tương tự tại Nga và Mỹ (ATCC 10577). * Phương pháp cấy chuyền: Dung dịch chứa bào tử được trải thành lớp trên môi trường đặc chứa cơ chất với những nồng độ khác nhau tùy thuộc vào quần thể nuôi cấy đang ở giai đoạn nảy mầm hay phát triển. Kết quả của phương pháp chọn lọc này chỉ đúng một phần trên các quần thể có những đặc tính khác biệt, hoặc dựa trên đặc điểm khoa học cơ bản hoặc dựa trên kinh nghiệm. Ví dụ như: sự chống lại giá trị pH thấp (Currier, 1917; Bernhaur, 1929), sự gia tăng nồng độ acid citric (Montan und Industialwerke, vorm. J.D. Stack, 1933; Bernhauer, 1934; Leopold, 1958), nhiệt độ (Leopold và Valtr, 1970), desoxyglucoses (Kirimura và cs., 1992), sự thích nghi với việc Hình 5: Nấm ở giai đoạn phát gia tăng nồng độ đường (Doelger và Presscott, triển sinh bào tử 1934; Schrefere- Kunar và cs., 1989; Xu và cs., 1989a), sự chọn lựa và thích nghi với nguồn C chỉ định như là vật liệu thô (Pelechova và cs., 1990). Quy trình này thường được dùng để bổ sung kết hợp với kĩ thuật bào tử đơn để cải tiến giống và cung cấp một vài giống cho những ứng dụng chuyên biệt. Như đã lưu ý ở trên, rất khó để duy trì những đặc tính mong muốn của chủng sản xuất trong một thời gian dài mà không làm mất đi khả năng phát triển và sản xuất acid. Nhiều phương pháp khác nhau để duy trì giống đã được vạch ra vì không có một qui trình chung nào được áp dụng. Một quy trình thường xuyên được áp dụng trong thực tiễn bao

14

gồm việc nuôi cấy trên môi trường hình thành bào tử ổn định, thu nhận các bào tử vô trùng trong giai đoạn sấy (ví dụ như trộn lẫn với các vật liệu trơ dạng bột), sấy bào tử với không khí vô trùng hoặc đưa chúng vào trong các tủ sấy ổn nhiệt. Cuối cùng, bào tử được bảo quản trong các ống thủy tinh được bịt kín hoặc trộn với đất khô cằn, cát khô, carbon đã được hoạt hóa bằng sắt tự do tại nhiệt độ thấp hay nhiệt độ phòng. Sự bảo quản bằng nhiệt độ cực thấp đã được đề nghị (Symonyan và cs., 1988) nhưng chỉ trừ một vài bản báo cáo được cấp bằng sáng chế với rất ít thông tin có giá trị. Sự ổn định của chủng giống khi sử dụng quy trình này thường là vài năm nhưng phải thường xuyên phân tích mẫu bởi có thể xảy ra sự nhân lên của bào tử và cần tiến hành thử nghiệm lên men ở quy mô nhỏ. Một vài tác giả đã đề nghị cải tiến chủng bằng cách gây đột biến gen. Tuy nhiên có rất ít chủng này được sử dụng vì rất nhiều công trình được công bố nhưng chúng có rất ít giá trị thực tế. Chiếu tia UV là cách thức đơn giản nhất và vì vậy nó là phương pháp được ưa chuộng. Bào tử được chiếu có nồng độ rất loãng (10 7- 108 mL-1) hoặc nuôi trên môi trường agar đặc bằng cách sử dụng đèn sát trùng bình thường. Theo Gardner và cs. (1956), đột biến UV ở mức cao ở chủng bố mẹ (Wisconsin 72-4) được phát triển trong các bước đột biến chồng. Mặt khác, Ilezuk (1969, 1970) đã đưa ra bằng chứng rằng sự phát triển giới hạn dẫn đến đột biến khuyết dưỡng là nguyên nhân làm gia tăng khả năng sản xuất acid. Một vài tác giả khác đã vạch ra mối tương quan giữa sự gia tăng sản xuất acid với đột biến cảm ứng sự thay đổi hình thái ở A. niger. Một vài phương pháp cải tiến giống khác có thể là chu trình cân giới tính, được đưa ra đầu tiên cho A. niger bởi Pontecorvo và cs., (1953). Tuy nhiên, các dị hợp tử như thể lưỡng bội đã góp phần cải tiến chủng công nghiệp (Chang và Terry, 1953; Ciegle và Raper, 1957; Ilezuk, 1971a). Theo bản báo cáo của Ilezuk(1971b) và Das, Roy (1978), thể lưỡng bội có hiệu suất sản xuất acid citric cao khi cha mẹ của chúng ở thể đơn bội, nhưng khuynh hướng này thường không bền (Bonateli và cs., 1983). Dung hợp protoplast ở Aspergillus bao gồm cả A. niger được vạch ra bởi nhóm của Ferenczy và Kevel tại Szeged, Hungary (Ferenczy và cs., 1975a,b; Ferenczy và Farkas, 1980, Ferenczy, 1984) và một nhóm khác của Feberdy tại Nortingham, Anh (Anne và Feberdy, 1975, 1976; Feberdy và Ferenczy, 1985; Feberdy, 1987; Powell và cs., 1993) là một công cụ đầy triển vọng (xem Gadau và Lingg, 1992) điều khiển di truyền của A. niger nhằm tăng hiệu suất sản xuất acid citric. Một vài nghiên cứu gần đây: - Kirimura và cs. (1986, 1988a) đã nghiên cứu sự dung hợp protoplast của chủng sản xuất và tạo ra được chủng có khả năng sản xuất acid vượt trội so với chủng bố mẹ khi lên men trên pha rắn nhưng không có tác dụng trong nuôi cấy chìm. Sử dụng phương pháp dung hợp bằng polyethylen glycol tỷ lệ phân chia là vào khoảng 5% (Martin và cs., 1990). Sự đơn bội hoá đã tạo ra những chủng trội hơn có thể sử dụng trong lên men chìm (Kirimura và cs., 1988b; Ogawa và cs., 1989) Tất cả các nghiên cứu nổi tiếng liên quan đến di truyền phân tử của Aspergilli đều được bắt đầu từ thập niên 1980. Một vài thành tựu chính có thể được kể đến: phát triển của một vài chủng mới có ích như kháng các thành phần bất lợi trong lên men vật liệu thô, có khả năng sử dụng vật liệu thô đặc biệt (tinh bột, cellulose, pectin, một vài loại vật liệu phế thải (ví dụ như whey- chất lỏng còn lại sau khi sữa chua đã đông…), cải tiến quá trình lên men. Những mục tiêu đặt ra là cần hiểu biết tường tận về cơ chế điều hòa quá

15

trình tích lũy và bài tiết acid citric, điều này có thể giúp cải tiến chủng vi sinh như là sự kết hợp giữa nấm men – một sinh vật đơn bào với A. niger. Nhiều bản báo cáo đã được tuyên bố hoàn toàn trong thời gian gần đây như là Bennet và Lasure (1985, 1991), Nealeinen và Penttila (1989), Bennet và Klich (1992), Powell và cs. (1994), Martinelli và Kinghorn (1994). 3.2 Nhân giống bào tử: Nhân giống ở quy mô lớn là một trong những khâu quan trọng và quyết định sự thành công khi vận hành các nhà máy sản xuất acid citric. Ví dụ một nhà máy muốn sản xuất 20.000ta-1 thì đòi hỏi cần phải cung cấp 30 – 300kg bào tử. Một số bào tử đã được sản xuất qua quá trình nuôi cấy chủng mong muốn trên những khay cạn chứa agar đặc trong phòng kín dưới điều kiện kiểm soát sự thông khí và độ ẩm. Cần duy trì điều kiện vô trùng ở mức cao bằng cách sử dụng hệ thống cung cấp hơi nước và các loại thuốc tẩy. Môi trường hình thành bào tử chứa một tỉ lệ thích hợp của nguồn carbon và nitrogen như mật đường, muối, peptones… Cần chú ý loại trừ các ion kim loại gây bất lợi cho môi trường. Bào tử từ dụng cụ bảo quản được thổi vào môi trường hình thành bào tử khô (10mg bào tử/m2). Sự hình thành bào tử bắt đầu tại 300C trên những luồng không khí vô trùng (thấp hơn 0.5 m/s) độ ẩm được cung cấp khoảng 70-90%, sau khoảng 6 ngày đã thấy kết quả bằng một màu thẫm, đó là những đám bào tử nấm sợi dày đặc. Bào tử được sấy vô trùng để nâng cao mức độ ổn định dưới điều kiện bảo quản. Sản lượng bào tử sấy khô là vào khoảng 60 - 120g/m2. Các bào tử đã sấy khô được thu hoạch cẩn thận bằng dụng cụ hút khí và được cất trữ ở một nơi lạnh khô. Mặc dù có rất ít thông tin và các thử nghiệm liên quan nhưng do duy trì được khả năng sản xuất acid với hàm lượng cao mà phương pháp bảo quản này vẫn được duy trì trong nhiều năm. Tuy nhiên cần phải tiến hành kiểm tra lại các bào tử bảo quản trước khi đưa vào sản xuất. Một vài phương pháp nhân giống bào tử khác đã được đề nghị như sử dụng cám (Foster, 1949) hay các loại hạt như bắp (Schweiger, 1965). Sự hình thành bào tử trong môi trường lỏng cũng đã được đề nghị. 3.3 Vật liệu thô: Có rất nhiều loại carbohydrate có thể được sử dụng trong sản xuất acid citric. Chúng được chia thành hai loại: 1.Vật liệu thô với hàm lượng tro thấp, trong đó các cation có thể được loại bỏ bởi các quá trình chuẩn. Loại cơ chất này có thể được kể đến như đường mía hay đường củ cải và tinh bột được làm tăng hoặc giảm độ tinh khiết như dung dịch dextrose và dextrose kết tinh. 2. Vật liệu thô với hàm lượng tro và tổng số các cơ chất không đường cao như mật đường mía và củ cải, các loại đường trái cây. Bên cạnh các loại vật liệu thô rẻ tiền, thì các vật liệu phế thải rẻ hơn nhiều như dung dịch còn sau khi sữa chua đông (whey), khoai lang, bột mì, bột lúa mì, hoặc cặn đường mía đã được đề nghị như là nguồn nguyên liệu. Việc sử dụng whey hay whey chảy tràn đã được nghiên cứu tại New Zealand (Hossain và cs., 1983, Maddox và Archer, 1984, Somkuti và Bencivengo, 1981). Trong hầu hết các trường hợp các loại vật liệu thô khác chỉ có tác dụng cục bộ và hiếm khi có chất lượng phù hợp to lớn. Thành phần của mật đường phụ thuộc vào nhiều nhân tố khác nhau. Ví dụ loại củ cải hay mía phương pháp trồng (chất dinh dưỡng, thuốc trừ sâu), điều kiện cất giữ, quá

16

trình sản xuất, phương pháp tiến hành (ví dụ sự chuyên chở, sự khác nhau về nhiệt độ), việc sử dụng các thành tựu có trước… Nhiều tác giả đã thử phân cắt mật đường để mô tả các tiểu phần có hại cho lên men acid citric (như là Zakowska,…, 1991). Mặc dù đã xuất hiện nhiều phương pháp phân tích khác nhau, nhưng công việc vẫn rất cần thiết để đánh giá sự phù hợp của các loại mật đường đối với số lượng, khả năng sản xuất và hoạt động điều chỉnh cho phù hợp. Mật đường mía với hàm lượng tro cao (7 – 10 %) và các chất hữu cơ không phải là đường (20 – 25%) được xem là kém phù hợp cho sản xuất acid citric ở quy mô lớn. Mật đường củ cải, là một loại vật liệu được ưa thích ở Châu Âu có thể chứa đến 80% chất rắn với 50% sucrose và khoảng 20 – 30% thành phần không đường. Tuy nhiên trong thời gian gần đây những nỗ lực lớn sản xuất đường củ cải trong công nghiệp để gia tăng số lượng đường từ những lượng trái cây phù hợp bằng những quy trình mới, mật đường đã được đưa vào thị trường (ví dụ mật đường Quentin) với hàm lượng đường <50% và hàm lượng các thành phần không đường tăng lên đã khiến nó không còn phù hợp cho sản xuất acid citric với quy mô lớn. Nhiều phương pháp sản xuất và tinh luyện đường đã ra đời nhưng đều bị loại bỏ mặc dù đường trong các vật liệu thô thường không nguyên chất. Về cơ bản, các thành phần trong môi trường do Currie đề nghị năm 1917 đã có sự biến đổi. Môi trường của Currie bao gồm 2-2,5g/L NH4NO3, 0,75- 1,0 g/L K2PO4, 0,200,25g/L MgSO4.7H2O. Trong nền công nghiệp hiện đại nguồn P, N như khí NH3, amoni hydroxide và acid phosphoric rẻ hơn, vì vậy, chúng được ưa chuộng hơn. Kim loại vết, đặc biệt là Zn, Fe, Mn được xem như là chất ô nhiễm hoá học. 3.4 Quy trình Koji Đây là quy trình đơn giản nhất cho sản xuất acid citric được phát triển ở Nhật Bản (Yamada, 1965). Nó gần giống như hình thức lên men trong môi trường rắn, dựa trên bí quyết của quá trình Koji truyền thống. Vật liệu thô là tinh bột thừa tại các nhà máy sản xuất tinh bột, như phế thải của khoai lang, gạo và các chất tương tự. Quy trình này được sử dụng nhiều ở Nhật Bản, khoảng 60.000 tấn phần xơ còn lại của khoai lang cho kết quả quá trình tương đương 30.000 - 40.000 tấn tinh bột, giá cả được tính tương tự như mật đường. Tinh bột được trộn với nước để thu được hàm lượng nước khoảng 65-70% và được xử lý với hơi nước nóng để làm nhão tinh bột. Hồ tinh bột vô trùng tạo ra được đưa lên khay hoặc trên bề mặt của buồng lên men và tiến hành cấy bào tử A.niger lên trên vật liệu. Trong trường hợp vật liệu có độ xơ kém, bã mía hay bã lúa mì có thể được thêm vào. Khay thường chỉ chứa được 10L( độ dài các chiều 0,6; 0,4; 0,05 m). Vì vậy, nó chỉ có khả năng sử dụng trong sản xuất nhỏ. Ở 30 oC và giá trị pH khoảng 5,5 thì amylaze của nấm mốc tiến hành quá trình đường hoá, sau đó chuyển đổi thành acid citric với dấu hiệu là sự giảm pH xuống còn khoảng 2. Sau từ 1-2 tuần, khối lên men chứa acid được ép và ly trích với nước nóng trong một máy chiết có dòng nước ngược đơn giản. Kết quả, là thu được dung dịch chứa khoảng 4-5% acid citric. Sự thành công trong quá trình đường hoá và acid hoá để tạo acid citric đòi hỏi phải có chủng A.niger đặc biệt, có 2 khả năng này. Trong trường hợp này, cần chú ý đề cập đến các chủng đã đựơc chọn lọc và kiểm tra trong len men chìm (Jin và cs., 1993; Seel và cs., 1993). Thêm vào đó, chủng cần chịu được nồng độ cao của kim loại nặng trong nhiều vật liệu phế thải. Một vài chủng đặc biệt được đề nghị đáp ứng những yêu

17

cầu này. Mặt khác, ảnh hưởng của ion kim loại thường chỉ giới hạn trong một vài quá trình lên men (Shankranand và Lonsane, 1994). Một vài quá trình tương tự được vạch ra khi sử dụng đường và bã đường mía (Lakshminarayana và cs., 1975) và mật đường mía (Chau, 1978) tại Ấn Độ. Một vài cách thức sử dụng vật liệu thải khác mới được phát triển gần đây như là: dứa hỏng (Yo, 1975; Usami và Fukutomi, 1977), nho vụn (Hang, 1988), bột táo nghiền (Xu và Hang, 1988). 3.5 Quá trình nuôi cấy bề mặt Đây là hình thức sản xuất acid citric cổ điển, môi trường nuôi cấy được chứa trong những bể hẹp và nấm phát triển thành hệ sợi trên bề mặt môi trường. Nên tạo ra sự tiếp xúc lớn giữa pha lỏng, hệ sợi nấm và không khí cung cấp lượng O2 yêu cầu. Khi tiến hành nuôi cấy lớn, việc đảo trộn pha lỏng nhờ gradient nhiệt độ và nồng độ theo chiều sâu chất lỏng. Như vậy, trong hệ thống phòng lên men có chứa một số lượng lớn các khay lên men cần được trang bị một hệ thống giá đỡ bền vững. Các khay thường được làm từ nhôm có độ tinh khiết cao hoặc từ thép không rỉ. Khay có thể có những kích thước khác nhau từ 2m x 2,5m x 0,25m đến 2,5m x 4m x 0,25m với mực chất lỏng thông thường từ 0,1 - 0,18m. Thể tích chất lỏng trong mỗi khay từ 0,5 - 2 lần khối lượng khay nên cần có các hệ thống giá đỡ. Các buồng lên men được gắn hệ thống thông khí hiệu quả với nhiệm vụ chính là điều hoà nhiệt độ, ngoài ra còn cung cấp O2 và điều hòa độ ẩm. Không khí được thổi vào phòng lên men theo từng lớp xuyên qua những đường dẫn tại tất cả các chiều cao của phòng lên men. Tường và sàn dùng để phủ vật liệu nên dễ cọ rửa và chịu được chất tẩy cũng tốt như chịu acid, cửa sổ nên được đóng chặt. Các phòng lên men nên được vô trùng bởi các chất tẩy rửa ở thể lỏng (phun) và thể khí (như khí sulhirdioxid hay folmaldehyde) và thường xuyên chà rửa tường và sàn với các chất tẩy dạng lỏng (xút hay dung dịch folmaldehyde). Tuy nhiên theo thử nghiệm cửa tác giả này thì việc khử trùng trong các phòng này không hiệu quả vì con người vẫn phải đi vào phòng lên men. Điều này dẫn đến sự nhiễm Pennillia, các chủng Aspergillus khác, nấm men và vi khuẩn sinh acid lactic. Mật đường được sử dụng trong lên men bề mặt được xử lí qua các bước sau: + Vật liệu khô được pha loãng để mật độ đường từ khoảng 120 – 180 kg/m 3, các chất dung dịch được bổ sung vào, dung dịch được acid hoá bằng cách sử dụng acid phosphuric để thu được pH là 6.0 - 6.5, đun nóng ở khoảng trong 15 – 45 phút. Sau đó, postassium hexacyanoferrate (HCF) được bổ sung vào dung dịch đang nóng. HCF có hai tác động quan trọng: giảm hoặc tạo thành phức hợp với các kim loại có hại (Fe, Mn) và hoạt động như là một chất ức chế chuyển hoá hạn chế sự tăng và cảm ứng sự sản xuất acid (Martin, 1955; Clark, 1964). Vì nhu cầu HCF phụ thuộc vào chất lỏng và loại mật đường sử dụng, vì vậy tốt hơn hết nên tiền hành sử dụng ở quy mô nhỏ với nhiều nồng độ HCF khác nhau để quyết định lượng HCF cần bổ sung, lượng HCF tự do trong quá trình xử lí với lượng HCF đủ có thể được quyết định bởi phương pháp của Marier và Clark (1960). Phương pháp HPLC cũng đã được xem xét đến (Selahzadch và Roehr, kết quả chua được công bố). Lượng HCF thừa có thể nằm trong khoảng từ 5 – 100 mg/l cho mật củ cải đường và 5 – 200 mg/l cho mật đường mía (Clark, 1964). Lượng chính xác được quyết định bởi thử nghiệm lên men ở quy mô nhỏ với chủng được chọn.

18

Dung dịch mật đường tích trữ ở dạng nóng hoặc được sử dụng ngay lập tức để đưa vào các khay khi nhiệt độ vào khoảng 40 oC. Việc phun không khí ẩm vào hệ thống được bắt đầu từ giai đoạn này để khử hơi nước đọng. Tốc độ làm lạnh quyết định số lượng lên men (Schimitz, 1976), tốc độ này nếu nhỏ hơn 1oC/h sẽ làm hạn chế tối đa thiệt hại. Việc cấy chủng cũng được tiến hành theo nhiều cách khác nhau: Một số lượng lớn hạt bào tử (khoảng 100 - 150mg/m 2) được đưa vào trong hệ thống bằng cách pha loãng hoặc đưa các bào tử sấy khô trên các khay. Sự nảy mầm đòi hỏi thời gian từ 1-2 ngày và trong suốt thời gian đó quá trình làm nguội có thể bị cản trở do sự gia tăng nhiệt độ dòng khí đưa vào. Trong suốt giai đoạn này và bước làm lạnh trước đó việc tránh tạp nhiễm đóng vai trò quyết định. Vì vậy, cần sử dụng các phương pháp vô trùng đặc biệt và không khí đưa vào trong giai đoạn này (chiếm 21% tổng lượng không khí) phải qua các thiết bị lọc, việc lọc không khí diễn ra trong suốt quá trình lên men. Sau khi bào tử nảy mầm, các hệ sợi nấm phát triển lan rộng thạch để thúc đẩy biến dưỡng cần thiết của quá trình sản xuất acid citric. Mật độ sợi nấm dày nhưng không bao phủ hoàn toàn vì điều này có thể làm giảm khả năng sản xuất acid. Khi mới bắt đầu hình thành sợi nấm, sự tạo thành acid citric đồng thời với sự giảm giá trị pH xuống nhỏ hơn 2 và quá trình này có thể hoàn thành trong thời gian từ 6-8 ngày. Việc trộn lẫn dung dịch lên men là cần thiết để duy trì nhiệt độ ở các lớp lên men không cách nhau quá 3oC. Trong suốt quá trình tỷ lệ acid tạo ra trung bình là vào khoảnh 0,5 kg CAM/m3h (CAM có nghĩa là citric acid monohydrate, FW 210.14 được bán rộng rãi ở Châu Âu, CAA là acid citric anhydrate, FW 192.13 được bán ở Mỹ. Nhân tố chuyển đổi là 1.094). Cùng thời gian này, lượng nhiệt thoát ra ngoài không khí nằm trong khoảng từ 600-1.100 kg/m2h. Vì khả năng hấp thu nhiệt độ của không khí kém nên tỷ lệ thông khí it nhất là 4V không khí /1V môi trường trong mỗi phút. Vì vậy, cần phải tính toán mức độ thông khí trong quá trình lên men bề mặt để bảo đảm yêu cầu về độ làm lạnh. Mặt khác, lượng nhiệt toả ra trong quá trình này bao gồm cả lượng nhiệt làm bốc hơi nước của cơ chất trong môi trường 30-40%. Như vậy, để quá trình lên men acid citric hiệu suất 75% cần nồng độ đường là 160kg/m3, quá trình lên men lỏng có thể thu được nồng độ acid citric 200-250kg/m3 Khi kết thúc quá trình lên men, các khay được lấy ra khỏi các phòng lên men, chuyển sang giai đoạn tinh sạch và lặp lại quá trình sản xuất. Các khay trống có thể được thay thế xoay vòng để có thể chuẩn bị cho quá trình lên men sắp tới. 3.6 Lên men chìm: Sản xuất acid citric với quy mô lớn sử dụng phương pháp lên men chìm tiếp tục được gia tăng mặc dù nó đòi hỏi nhiều kĩ thuật tinh vi phức tạp. Người ta đánh giá khoảng 80% lượng acid citric sản xuất trên toàn thế giới là do phương pháp lên men chìm. Ưu điểm của phương pháp này có thể kể đến như là số lượng và khả năng sản xuất cao cũng như giảm chi phí thuê nhân công đã được dùng để bào chữa cho sự thật là có rất nhiều thông số hoạt động đã được nghiên cứu lại để bổ sung vào kĩ thuật này. Các sinh vật thường rất nhạy cảm với sự chuyển đổi các kim loại vết, đặc biệt là Fe3+ và Mn2+ (Clark và cs., 1966). Nồng độ của Fe3+ là 1mg/l và của Mn2+ là 2mg/l (Snell và Schweiger, 1949). Cần nhận thức rõ điều này khi chọn vật liệu cho vào fermenter và

19

sắp đặt hệ thống ngoại vi tương tư như chuẩn bị nguồn cung cấp nước cho nhà máy. Xử lý phù hợp cơ chất C là điều không thể thiếu và sẽ được diễn tả ở phần dưới. Nồng độ O2 phải được duy trì trên 25% trạng thái bão hoà và sự cung cấp gián đoạn O 2 sẽ gây hại cho lên men. Lên men chìm có thể được tiến hành trong các lò khuấy trộn truyền thống như những fermenter dạng tháp. Sau này, bioreactor được lựa chọn sử dụng nhiều hơn bởi vì nó có những ưu điểm vượt trội so với lò phản ứng khuấy trộn: giá thành rẻ hơn, có thể xây dựng với kích thước lớn, hoạt động mà không cần hệ thống khuấy lớn từ đó giảm khả năng tạp nhiễm và sản xuất ít nhiệt hơn với huyền phù rắn. Fermenter khuấy trộn có khả năng chứa 50 đến 100m3 trong khi đó fermenter dạng tháp có thể chứa thể tích lên đến 1000m3. Vì sự nhạy cảm của A. niger đối với hàm lượng nhỏ các kim loại nặng có thể đã được hoà tan từ vật liệu xây dựng vì sự ăn mòn của acid citric, vì vậy việc sử dụng các kim loại không bị ăn mòn trong tất cả các phần của hệ thống lên men là điều cần thiết. Vật liệu tốt nhất là AISI 316 Ti không rỉ (1.4571, Din X10CrNiMoTi 1810) hoặc các loại vật liệu chuyên biệt tương tự. Thêm vào đó, fermenter và các ống ngoại vi nên được chống rỉ bởi các quá trình bình thường như làm phủ đầy với hỗn hợp dung dịch acid sulfuric và acid nitric và để thông gió trong khoảng 20h. Fermenter cho quá trình lên men acid citric không được làm khi tồn tại áp suất ống vì sự khử trùng thường được thực hiện bằng hơi nước sau khi lò phản ứng đã được rửa sạch mà không chịu tác động của áp lực (chỉ khoảng 0,2 bar). Quá trình lạnh có thể được thực hiện bởi các hơi nước ngoại vi bám trên bề mặt ngoài của fermenter.

Hình 6: Quy trình lên men chìm sản xuất acid citric từ mật đường 20

Sự thông khí được thực hiện bởi các phương pháp xua khí bình thường của công nghiệp lên men nấm mốc. Fermenter tháp thường có tỉ lệ giữa chiều cao và đường kính là 4:1 đến 6:1. Vì vậy, sự gia tăng áp suất thuỷ tĩnh làm gia tăng khả năng hoà tan của O 2. Thông thường việc duy trì nồng độ O2 cao hơn 25-50% trong suốt quá trình là tương đối dễ dàng. Sự khuấy trộn có thể giảm hiệu quả trong các termenter dạng thấm nhưng vấn đề này hiếm khi gây nguy hiểm. Các ống thông gió có thể được xây dựng ở bên trong nhưng tác động của chúng bị giới hạn khi tiến hành nuôi cấy theo hình thức fed-batch. Các fermenter có thể được cấy chủng giống theo nhìêu cách khác nhau. Dung dịch bào tử trộn lẫn với Tween làm cho sự phân tán dễ dàng để nồng độ bào tử cuối cùng là 2-25 x 106 bào tử/L. Sự ủ bào tử trước từ 6 - 8h có thể làm bước I của quá trình lên men ngắn lại. Hay theo cách khác, hệ nấm sợi có thể được phát triển trước trong các giống hạt (Tveit, 1963). Theo cách này, hệ nấm sợi được sản xuất trong các pellet hoặc flock có kích thước không đổi. Như đã đề nghị ở trên, loại vật liệu thô được sử dụng như là nguồn C quyết định thao tác của quy trình. 3.6.1 Hỗn hợp những đường và lên men fed-batch Mặc dù những thí nghiệm đầu tiên được tiến hành theo phương pháp lên men chìm sử dụng nguyên liệu đường tinh khiết, các quy trình sử dụng mật đường như một nguồn cơ chất thô, rẻ tiền được nghiên cứu ứng dụng hầu hết trong việc sản xuất acid citric. Hạn chế trong trường hợp này là tồn tại nhiều các hợp chất không phải là đường. Giống như lên men ethanol, tốc độ lên men acid citric bị giảm đột ngột khi gia tăng nồng độ đường. Vì vậy, phương pháp lên men theo mẻ hiện tại chỉ được sử dụng trong trường hợp nồng độ nguyên liệu ban đầu thấp. Do đó, phương pháp lên men bán liên tục được ưa chuộng hơn hiện nay. Trong lên men theo mẻ, nồng độ nguyên liệu thô ban đầu có thể là 250kg/m 3, trong đó nồng độ đường vào khoảng 120kg/m3. Đối với phương pháp lên men bán liên tục nồng độ đường trung bình vào khoảng 150kg/m3. Ban đầu chỉ tiến hành với ½ mẻ dịch lên men, trong đó nồng độ đường vào khoảng 100 kg/m3. Chính vì vậy lượng rỉ đường ban đầu phải chứa tất cả là 200kg/m3. Kết quả là một lượng 130 kg/m3 acid citric (loại CAM) được thu nhận trong 6 ngày, với năng suất lên men là 0,9 kg CAM/m3.h. Quá trình trên có thể dao động trong một giới hạn nhất định. Theo HUSTEDE và RUDY (1976) một lượng HCF cần thiết có thể được thêm vào để quá trình lên men được thuận lợi hơn, cụ thể là vào giai đoạn xử lý nguyên liệu rỉ Hình 7: Sơ đồ lên men citric

21

đường. Ngoài ra, việc bổ sung chất ức chế HCF có thể cần thiết trong một số giai đoạn phát triển của nấm mốc. 3.6.2 Lên men theo mẻ sử dụng nguyên liệu đường tinh - Quy trình lên men sử dụng đường tinh khiết được biết đến đầu tiên nhưng hiếm khi được sử dụng vì giá nguyên liệu thô cao. Do đó việc gia tăng tiềm kiếm, phát hiện những nguồn nguyên liệu rẻ tiền ,có giá trị kinh tế cao là rất quan trọng hiện nay. - Với mật đường cũng là một nguồn cơ chất (nguyên liệu) quan trọng hiện nay… Mật đường trước tiên được xử lý thành dạng dung dịch chuẩn bị cho lên men. Mật đường cũng như các nguyên liệu đường tinh khiết khác (như đường mía, củ cải đường)có thể tránh được tác hại của các ion kim loại bằng cách xử lý với nhựa trao đổi cation trong công nghiệp. Theo nội dung đã trình bày ở trên, không cần bổ sung chất ức chế nếu nồng độ ion sắt dưới 1 mgL-1. Chỉ cần một lượng nhỏ chất ức chế HCF (1-10mg L-1) là đủ gây ra sự chuyển đổi từ sự sinh trưởng của nấm mốc thành sự sản xuất. - Trong 1 quy trình lên men điển hình một lượng 300kg.m -3 dung dịch đường cơ chất sẽ được chuẩn bị ở 400C, pH: 1,6-1,8 (sử dụng axit sunfuric) dung dịch đường này sẽ thực hiện trao đổi cation mạnh nhằm làm giảm ion sắt và mangan lần lượt xuống dưới 200ugL-1 và 5ugL-1. Sau đó, dung dịch (lên men) đường được lọc, thanh trùng và chuyển vào nồi lên men. Lượng đường sucrose tổng cộng trong dung dịch lên men có thể dao động trong khoảng 160 - 250kg.m-3, trong khi đó với đường glucose trường hợp con số này 120 - 160kg.m-3. Do trong quá trình lên men đường glucose bị biến đổi, dẫn đến kéo dài thời gian lên men. Sau khi bổ sung muối dưỡng chất và HCF, pH của dung dịch tăng lên 2,5 - 3,0. Để tạo điều kiện để quá trình lên men thuận lợi ta có thể bổ sung khí amoniac (NH3) hay amoni hydroxide (NH4OH) như môt phần dưỡng chất. - Lúc này, các bào tử nấm mốc hay hệ sợi nấm đã tăng trưởng trước đó được cấy vào hệ thống lên men, lượng bào tử nấm mốc có thể dao động trong khoảng 5 - 25.10 6 bào tử/lit. Cho đến khi bào tử nảy mầm, sự thông khí phải đựơc duy trì ở mức độ khoảng 0,1 vvm.Trong suốt giai đoạn sinh trưởng của hệ sợi nấm đựơc đặc trưng bởi các cầu nối ngắn phân nhánh cùng với bề mặt lồi của các tế bào . - Đây cũng là điều kiện tiên quyết để giới hạn sự tăng trưởng của nấm mốc và mở rộng sản suất axit citric. - Hình thái nàycó được do sự hoạt động của chất ức chế HCF và sự giảm nồng độ 3+ Fe và Mn2+. Nếu nguyên liệu khô ban đầu không được xử lý hay các chất dinh dưỡng đưa vào không sạch sẽ dẫn đến nồng độ cao của các ion Fe 3+, Mn2+ có trong dung dịch lên men và việc giới hạn tăng trưởng của nấm mốc sẽ không được thiết lập, hiện tượng này đặc trưng bởi sự xuất hiện những cầu nối dài, không phân nhánh cùng sự gắn kết các cầu nối lại với nhau như tơ nhện về mặt hình thái của nấm mốc. Chỉ khi dấu hiệu hình thái đầu tiên được phát hiện (hình thành các cầu nối dài, không phân nhánh) nhờ quan sát dưới kính hiển vi thì hiện tượng này có thể đựơc khắc phục bằng cách bổ sung chất ức chế. - Việc tạo các mấu lồi tròn ở dạng nấm mốc đặc biệt này đòi hỏi 2 - 3 ngày cùng với sự giảm giá trị pH xuống 1,6-1,8. Trong nhiều hệ thống, pH được duy trì ở giá trị lớn hơn 2 trong suốt quá trình lên men để tránh cản trở của pH thấp. Sau thời gian 2 ngày, sự tạo acid citric được bắt đầu và nên được kiểm tra thường xuyên bằng phương pháp chuẩn độ. Như đã đề cập ở trên, sự thông khí có ý nghĩa rất quan trọng trong lên men tạo acid

22

citric. Việc dừng thông khí, dù chỉ trong một thời gian ngắn, cũng đủ làm giảm đáng kể quá trình lên men. - Tuỳ thuộc vào nồng độ đường ban đầu, việc sản xuất acid citric kết thúc vào giữa ngày thứ 9 và ngày thứ 12 của quá trình lên men. Năng suất lên men thuờng lớn hơn 1kg.m-3h-1 với sản lượng CAM trên lượng đường tiêu thụ vượt quá 90%. 3.6.3 Lên men dạng hỗn hợp (kết hợp) - Quá trình lên men sử dụng nguyên liệu đường tinh sạch rất nhạy cảm với nguồn cơ chất ban đầu cũng như chịu nhiều ảnh hưởng bởi một lượng nhỏ các chất ức chế. Chính vì vậy đã làm bùng nổ cuộc cách mạng tìm kiếm một quy trình sản xuất khác thuận lợi hơn. - Sự việc này dẫn đến hình thành phương pháp lên men bán liên tục. Đầu tiên môi trường mật đường được xử lý với nồng độ trung bình (60-100kg.m-3) cùng với lượng cao chất ức chế HCF. Sau đó dung dịch đường tinh sạch ở nổng độ cao (300kg.m-3) được đụa vào nồi lên men. Các bước tiếp theo tương tự với quy trình đã mô tả ở trên. Sản lượng và tốc độ lên men của phương pháp lên men bán liên tục tương đương với phương pháp lên men theo mẻ sử dụng đường tinh sạch. 3.6.4 Sự lên men từ các nguyên liệu không tinh - Việc tận dụng được các sản phẩm phế thải từ nhiều lĩnh vực khác nhau như một nguồn cơ chất lên men đã đánh dấu một bước tiến tiêu biểu cho ngành công nghiệp sản xuất acid citric. - Vào năm 1961, trong khi cố gắng ngăn chặn sự xâm nhiễm, nhà khoa học Schweiger đã quan sát thấy ảnh hưởng độc hại của ion sắt trong dịch lên men có thể bị hạn chế bằng cách sử dụng ion đồng với một tỉ lệ nhất định. Nếu ion sắt không được loại bỏ xuống mức cho phép thì việc sử dụng một lượng cao ion đồng sau đó sẽ gây hại cho quá trình lên men, làm giảm năng suất. Bên cạnh đó, một số nhà khoa học cho rằng mục tiêu chủ yếu của hoạt tính ion đồng là mangan kim loại. - Việc sử dụng ít nguyên liệu thô qua tinh sạch và bổ sung ion Cu 2+ để kiểm tra hoạt tính độc hại của ion sắt/mangan, đặc trưng cho công nghệ Miles nổi tiếng, có thể được xem như một công nghệ ưu vịêt nhất hiện nay. - Những thử nghiệm nhằm đưa các công nghệ truyền thống như sử dụng các tế bào cố định, lên men liên tục vào trong quy mô công nghiệp cho đến nay vẫn chưa thành công. Môi trường lên men liên tục với các tế bào nấm mốc không bất động, sử dụng nguyên liệu đường glucose, thu được nồng độ acid citric ở hai giá trị 2 và 6g.L -1 với năng suất vào khoảng 0.4gL-1h-1 tại tốc độ pha loãng 0.075 h-1.. Tuy nhiên nồng độ đường còn lại sau lên men đo được là 40gL-1. Một vài nhóm nghiên cứu đã đưa ra các phương pháp khác nhau như: để tế bào nấm mốc bất động bám trên vật mang thuỷ tinh hay gắn vào calcium alginate… Cho đến nay, hạn chế chủ yếu của các phương pháp này chính là:việc làm giảm tốc độ pha loãng để có được lương đường dư phù hợp vẫn làm giảm năng suất và nồng độ đường sản phẩm trong sản xuất ở quy mô công nghiệp. 4. SỰ THU HỒI VÀ TINH SẠCH SẢN PHẨM - Hệ khuẩn ty từ quá trình nuôi cấy bề mặt dễ dàng được tách ra khỏi dung dịch lên men, sau đó được làm tan rã một cách cẩn thận rồi đưa thẳng vào trong thiết bị tẩy rửa. Việc rửa sinh khối nấm mốc là rất cần thiết vì nguyên liệu thấm nước giữ lại được

23

khoảng 15% sản phẩm acid citric tạo ra trong quá trình lên men. Nước rửa này sẽ được bổ sung vào dịch lên men. Kế đến, lượng sinh khối nấm mốc này được lọc khử nước, sấy khô để làm thành thức ăn gia súc giàu protein. - Trong quy trình nuôi ấy chìm, việc tách rời màng mốc ra khỏi dung dịch lên men khó hơn nhiều và được thực hiện bởi một thiết bị lọc tích điện vành đai. Giai đoạn lọc này thực sự rất khó khăn do các chất nhầy ở hệ sợi nấm được tiết ra trong suốt quá trình lên men. Trong những trường hợp như vậy, các chất hỗ trợ lọc sẽ được bổ sung. Nếu hệ sôi nấm được sử dụng để làm thức ăn gia súc thì các chất hỗ trợ lọc phải tiêu hóa được. Ngoài ra có thể nhắc đến gypsum - một chất hỗ trợ lọc trung gian được tích lũy chủ yếu trong giai đoạn thu hồi và tinh sạch sản phẩm acid citric. Các bước lọc thường được kết hợp với việc gây kết tủa oxalate - một chất phải được loại bỏ bởi độc tính của nó. Gypsum được sử dụng sẽ phản ứng với oxalate tạo thành calcium oxalate. Gypsum có thể đươc cho vào vượt mức mà vẫn không sợ rủi ro đối với việc kết tủa oxalate. - Ngoài ra, dịch lên men cũng chứa hỗn hợp các chất không mong muốn có trong nguyên liệu thô ban đầu cũng như các hợp chất làm giảm sinh khối nấm men. Chính vì vậy việc tinh thể hoá trực tiếp acid citric đòi hỏi hơn nữa các bước tinh sạch trong điều kiện thí nghiệm. Mặt khác, một số quy trình tiến hành thu hồi muối kiềm của acid citric bằng cách tinh thể hoá trực tiếp từ dịch lên men, sau đó trung hoà lần lượt các hợp chất kim loại kiềm để thu nhận muối đơn, đôi hoặc muối ba citrate. Cuối cùng cho bốc hơi các muối trên còn khoảng 400gL-1, được tính như acid citric. - Nhìn chung quá trình thu hồi và tinh sạch acid citric có thể được hoàn thành bởi ba phương pháp sau: kết tủa, tinh chế và hấp phụ (chủ yếu sử dụng nhựa trao đổi ion). - Gây kết tủa, phương pháp cổ điển, được thực hiện bằng cách bổ sung calcium oxide để tạo ra tricalcium citrate tetrahydrate hoà tan. Thành công của việc gây kết tủa phụ thuộc vào một vài nhân tố sau: nồng độ acid citric, nhiệt độ và pH trong suốt quá trình gây kết tủa. Nếu kết tủa hiệu quả thì lương lớn các chất bẩn sẽ nằm lại ở phần dung dịch và có thể được loại bỏ bằng cách lọc kết tủa. - Sau khi lọc và rửa, calcium citrate thu được tiếp tục cho phản ứng ở 50 0C với acid sulfuric nồng độ trung bình (60-70%). Tiếp theo, calcium sulfate (gypsum) và acid citric tự do được tách riêng nhờ lọc. Phần nước lọc sau đó được xử lý với than hoạt tính để loại bỏ tạp chất màu và được cho qua nhựa trao đổi ion để loại calcium sulfate dư cùng các ion kim loại. Việc xử lý dịch lọc thô với hydrogen peroxide trước khi cho qua cột trao đổi ion cho hiệu quả lọc cao, đặc biệt để loại bỏ hoàn toàn các hợp chất carbon. Sau đó tiến hành bốc hơi dung dịch acid citric tinh khiết ở nhiệt độ dưới 40 0C để tránh sự caramen hoá. - Citric acid monohydrate (CAM), sản phẩm chủ yếu được bán ở Châu Âu, được hình thành ở nhiệt độ dưới 36,5oC. Trên nhiệt độ này, citric acid anhydrate (CCA) được tạo ra. Sản phẩm CAA được thương mại hoá trên khắp nước Mỹ và Đông Nam Á. - Hạn chế đáng kể của việc thu hồi acid citric chính là một lượng lớn gypsum được tạo ra (khoảng 1tấn/tấn CAM) bị vứt bỏ, trở thành rác thải. Bên cạnh đó, việc sử dụng một lượng đáng kể nhựa trao đổi ion có thể tạo ra các nguồn gây ô nhiễm môi trường. Tất cả đều làm gia tăng gánh nặng cho công tác bảo vệ môi trường vốn đã rất nan giải.

24

5. SẢN XUẤT ACID CITRIC TỪ NHỮNG NGUỒN CƠ CHẤT VÀ SINH VẬT KHÁC Cho tới tận những năm 1970, Asp. niger hầu như vẫn là sinh vật duy nhất được sử dụng trong sản xuất acid citric, mặc dù không có nghĩa là chỉ có loài sinh vật này và những loài họ hàng gần gũi của nó mới có khả năng sản xuất acid citric. Đó là A. awamori, A. carbonarius, A. fonsecaeus, A. foetidus, A. phoenicis thuộc nhóm Nigri Gams và al. (A. niger nhóm Thom và Church, 1926). Nhưng cũng có một ngoại lệ đó là A. wentii thuộc nhóm Wentii Gams và al. (A. wentii nhóm Thom và Raper, 1945). A. wentii được phát hiện và được cấp patent bởi khả năng sản xuất acid tốt (Waksman và Karow, 1946; Karow và Waksman, 1947) nhưng không được ứng dụng trong công nghiệp. Perlman và Sim (1960) bổ sung thêm vào danh sách các giống A. clavalus, A. fumaricus, A. luchensis, A. saitoi, A. usamii. Cũng tương tự như vậy, những loại nấm sợi không được tận dụng mặc dù một vài patent liên quan đã được đề cập tới: Kinoshita và cs. (1961a) đã nghiên cứu kỹ công dụng của Penicillium janthinellum var. kuensanii (ATCC 13154) và P. restrictum var. kuensanii (ATCC 13155). Năng suất đạt trên 80% trên cơ chất đường tiêu thụ (rỉ đường) sau 7d lên men. Trong công trình này, tác giả cũng đã có tham khảo những Pencillia khác trong “Manual of the Penicillia” của Raper và Thom (1949) về khả năng sản xuất acid citric. Trường hợp khác nữa là trong patent của Kinoshita và cs. (1961a) đã nêu ra một vài giống khác thuộc Trichoderma viride, như giống ATCC 13233 cũng có thể cho ra acid citric. Trong môi trường có hàm lượng cơ chất carbon 100g/L (khoai tây thô hay khoai lang), năng suất đạt 75% trên tinh bột thêm vào và 85% trên tinh bột tiêu thụ, trong 7d lên men. Lợi thế của những quy trình này là sự có sẵn amylase và cellulase trong cơ thể sinh vật, không nhạy cảm với kim loại nặng, không có sản phẩm phụ được tạo ra. Tuy nhiên, những quy trình như thế vẫn không đi vào hoạt động công nghiệp. Những sinh vật đầy hứa hẹn khác cũng đã được tìm ra thuộc nhóm nấm men, như giống Candida và những giống tương tự. Chúng có khả năng phát triền trên nguồn carbon n-alkan để lên men tạo acid citric. Theo Yamada (1977), việc sản xuất acid citric từ nparaffin mạch thẳng từng được nghiên cứu bởi nền công nghiệp Nhật Bản từ những năm 1960. Các phân đoạn paraffin mạch thẳng khác nhau ( khoảng từ C9 đến C2O) là cơ chất thích hợp. Các nhân tố quan trọng khác được đề cập tới là pH và nồng độ ion sắt. Giá trị pH nên được giữ trên 5, pH thấp hơn sẽ dẫn đến việc hình thành các polyol như erythritol và arabitol (Tabuchi và Hara, 1973). Nồng độ ion sắt vượt mức làm giảm đáng kể năng suất lên men của Saccharomycopsis lipolytica, có lẽ là do tăng khả năng hoạt động của aconitate hydratase (Tabuchi và cs., 1973). Marchal và cs. (1977b), Behrens và cs. (1978) cho là quá trình lên men acid citric được bắt đầu tích luỹ sau khi đã sử dụng hết hoàn toàn nguồn N trong môi trường. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc duy trì một tỉ lệ P : C nhất định như 0,1.10-3 – 2,0.10-3 : 1 trong suốt quá trình lên men sẽ bảo đảm năng suất cao ổn định của acid citric (Fukuda và cs., 1982). Những chủng nấm men có vai trò quan trọng trong sản xuất acid citric gồm có: - Candida brumptii (C. catenulata) - Candida guilliermondii - Candida intermedia

25

Candida lipolytica (Yarrowia lipolytica) Candida oleophila Candida parapsilosis Candida tropicalis Candida zeylanoides Rhodotorula Saccharomycopsis lipolytica (Yarrowia lipolytica) Một bất lợi của việc sử dụng nấm men là sự hình thành một lượng lớn acid isocitric, lên tới hơn 50% lượng acid tạo thành. Vấn đề này có thể được khắc phục bằng cách chọn lọc các chủng đột biến, chủ yếu là giảm hoạt động của aconitate hydratase. Mặt khác, sự hình thành acid isocitric có thể được kiềm chế bằng cách bổ sung chất hoạt động bề mặt (Matsumoto và cs., 1983) hay đưa khí oxy vào (Matsumoto và Ichikawa, 1986). Cuộc khủng hoảng dầu mỏ 1974/73 đã kết thúc hầu như toàn bộ việc sử dụng n– alkan như một nguồn nguyên liệu cho sản xất acid citric. Tuy nhiên chính trong thời điểm này, nấm men được đánh giá cao bởi khả năng sử dụng carbohydrate như một nguồn carbon (Tabuchi và Abe, 1968; Tabuchi và cs., 1969; Lizuka và cs., 1969; Shimizu và cs., 1970; Abe và cs., 1970). Đặc biệt kể từ khi tìm ra được những chủng có khả năng đồng hoá fructose chậm, những cơ chất như mật rỉ đường hay hỗn hợp đường được dùng cho việc sản xuất đồng thời acid citric và fructose (Uchio và cs., 1979). Từ những hướng nghiên cứu mở rộng này, người ta cũng nhận thấy lên men glucose cho năng suất acid citric tương tự như sử dụng alkan (Behrens và cs., 1986). Một số hướng cải tiến khác như: thay đổi nguồn cung cấp oxygen (Stottmieister và cs., 1986), tạo sự thích nghi ban đầu cho tế bào trên môi trường methionine cao (Barth và Krebs, 1985) hay tiền nuôi cấy tế bào trên môi trường alkan rồi sau đó chuyển sang môi trường glucose (Weissbrodt và cs., 1987a). Sau này, ngoài glucose, ethanol cũng được đề nghị làm nguồn nguyên liệu bởi vì cho được sản phẩm tinh hơn. Với A. niger, những cải tiến khác được đưa ra để có thể tiếp tục sử dụng tố hơn, đó là ứng dụng những kỹ thuật mới như cố định tế bào hoặc là nuôi cấy bán liên tục. 6. SINH THÁI LÊN MEN - Việc thu hồi acid citric từ dịch lên men thường đi kèm với việc tích luỹ một lượng lớn các sản phẩm trung gian. Khoảng 2,5 tấn phế liệu (tính trên khối lượng khô) được tạo ra trong quá trình sản xuất CAM, chủ yếu là gypsum (khoảng 60% tổng số), theo sau là các chất tan trong dịch đã lên men và lượng sợi nấm phế thải. Việc đáp ứng các yêu cầu bắt buộc về sinh thái đòi hỏi nhiều bước tiến hành nhằm làm giảm thiểu gánh nặng môi trường và tạo khả năng tận dụng các phế liệu. - Gypsum: như đã đề cập ở trên, trong nhiều trường hợp việc tích tụ gypsum phế thải không thể kéo dài. Vì vậy, một số quy trình tinh lọc đã từng được thử nghiệm và thành công trong việc loại bỏ gypsum cùng một số sản phẩm trung gian đi kèm như hệ sợi nấm phế thải. Bên cạnh đó, gypsum tinh khiết có thể được sử dụng như một loại vật liệu xây dựng điển hình hay như một loại thuốc nhuộm phủ ngoài giấy. Ngoài ra, gypsum còn có thể được chuyển đổi thành dạng chất hàn gắn gypsum hay thành dạng xi-măng khoáng sulfol.

-

26

- Hiện nay có nhiều ý kiến cho rằng quá trình sản xuất gypsum tinh khiết từ các nguồn phế thải khác nhau sẽ mang lại lợi nhuận. Điều này ngược lại sẽ tác động đến kinh tế của các cơ sở tạo ra gypsum phế thải. Ngoài ra, một vài nhà nghiên cứu đã từng đề nghị xem xét phản ứng nổi bật giữa calcium sulfate với carbondioxid và ammonia nhằm tạo ra calcium carbonate và amonium sulfate. Cả hai sản phẩm này đều có nhiều ứng dụng khác nhau. Tương tự phản ứng với sodium carbonate cũng tạo ra calcium carbonate và sodium sulfate. - Hệ sợi nấm được thải ra từ quá trình nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm có thể được sấy khô và sử dụng như một loại thức ăn gia súc hay được biến đổi làm phân bón. - Dịch thải từ quá trình gây kết tủa calcium citrate có thể cho bốc hơi để tạo sản phẩm “vinasse”- được sử dụng như một loại thức ăn cho gia súc. Tuy nhiên do hàm lượng cao các hợp chất vô cơ có trong sản phẩm mà ứng dụng này có phần bị hạn chế. Ngoài ra, do những vấn đề kĩ thuật cũng như yêu cầu năng lượng ban đầu cao nên quá trình xử lý này ít được chấp nhận. Hiện nay, trong các nhà máy lớn, hỗn hợp dịch thải ra được xử lý thông qua một nhà máy xử lý nước thải lớn. Việc bổ sung các bước kị khí ngày càng trở nên phổ biến với hệ thống xử lý nước thải sử dụng bùn hoạt tính. 7. ỨNG DỤNG - Acid citric, với vị chua dễ chịu cùng đăc tính hoà tan nhiều trong nước, là một acid quan trọng trong công nghiệp thực phẩm như dùng trong sản xuất bánh kẹo, nước giải khát, đồ hộp rau quả, thịt cá, mứt trái cây. Ngoài ra acid citric còn được sử dụng trong các ngành công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm cũng như trong sản xuất các chất tẩy rửa. - Muối của acid citric cũng được sử dụng trong một số các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Trisodium citrate và acid citric có thể trộn lẫn với nhau để tạo dịch muối đệm với một giá trị pH bất kì. Aluminum citrate từng được xem như một tác nhân gắn kết hiệu quả đối với CM-cellulose hoặc với phần nào nhựa polyarylamid bị thủy phân nhằm nâng cao quy trình thu hồi dầu mỏ. - Trong những năm 1970, các nhà khoa học nhận thấy có rất nhiều các acid polycarboxylic không bền được sinh ra từ quá trình phân huỷ nhiệt của calcium citrate. Các hợp chất này được sulfon hoá để tạo ra acid sulphopolycarboxylic (SPC). Ester của SPC là một chất tẩy rửa tuyệt vời. Việc sản xuất các ester của acid citric cũng được ứng dụng trong công nghiệp nhựa. Ngoài ra acid citric còn được sử dụng như một chất thấm hút trong việc loại bỏ SO2 từ khí thải. Ngoài ra, do những vấn đề kĩ thuật cũng như yêu cầu năng lượng ban đầu cao nên quá trình xử lý này ít được chấp nhận. Hiện nay, trong các nhà máy lớn, hỗn hợp dịch thải ra được xử lý thông qua một nhà máy xử lý nước thải lớn. Việc bổ sung các bước kị khí ngày càng trở nên phổ biến với hệ thống xử lý nước thải sử dụng bùn hoạt tính.

27

1.

GIỚI THIỆU: Những nguyên tắc lên men acid lactic công nghiệp có lẽ đã được đưa ra từ những năm 1857, khi Louis Pasteur đề cập tới trong tác phẩm nổi tiếng: “Mémoire sur la fermentation appelée lactique”. Kể từ đó, đặc biệt cùng với việc cô lập được nhiều chủng vi khuẩn sinh acid lactic khác nhau, công dụng của những chủng vi sinh vật ngày càng trở nên quan trọng cùng với sự Hình 8:Công thức cấu tạo phát triển của nhân acid lactic loại. Những sản phẩm lên men từ sữa, rau, ngũ cốc, thịt cũng như trong việc bảo quản một số nguyên liệu là những ứng dụng thực tế trong lên men acid lactic. Vi khuẩn lactic đóng một vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp, đặc biệt công nghiệp chế biến sữa. Nói đến vi khuẩn lactic là nói đến một khái niệm chung, bao quát. Chúng là những vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy ý gram dương. Những đặc tính sinh học và sinh hóa đã được đề cập rất nhiều trong các nghiên cứu khác nhau ví dụ của Balow và cs.,(1991). Trong phần này chúng ta chỉ nói đến đặc tính làm cho vi khuẩn lactic có ứng dụng quan trọng trong các quá trình công nghiệp. Hình 9: Cấu trúc acid lactic 2. ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HÓA CỦA LÊN MEN ACID LACTIC CÔNG NGHIỆP

- Vi khuẩn lên men đồng hình và lên men dị hình: Cả hai nhóm vi khuẩn này đều tận dụng được tốt con đường biến dưỡng EMP của chuỗi chuyển hóa glucose tạo sản phẩm cuối acid lactic. Chúng tham gia cả vào con đường chuyển hóa đường pentose thu được acid lactic cùng với các sản phẩm khác như acid acetic, ethanol, CO2.

28

29

Hình 10: Quá trình lên men acid lactic dị hình

1919, Jensen đưa gọi tên lên đồng hình men dị ông cũng phân biệt chủng vi khác nhau, xếp chúng nhóm này Vi lên men hình là chính sản acid lactic mại. Tuy

Năm Orlara cách men và lên hính, đã các khuẩn sắp vào hai khuẩn đồng nguồn xuất thương nhiên,

Hình 11: Quá trình lên men acid lactic đồng hình

30

phương thức lên men đồng hình cũng có thể thay đổi thành lên men dị hình nếu nồng độ của nguồn C chính giảm xuống dưới mức giới hạn cho phép (De Vries và cs., 1970). - Vi khuẩn ưa nhiệt (Mesophilic bacteria) và chịu nhiệt (Thermophilic bacteria) Mesophilic lactic acid tăng trưởng tối ưu trong khoảng 28-45oC. Còn thermophilic lactic acid là 45-62oC, tùy thuộc từng giống. Trong chế biến sữa, dựa vào nhiệt độ tăng trưởng người ta phân biệt ra: Thermobacterium, Streptobacterium và Betabacterium. Việc sử dụng những chủng vi sinh vật chịu nhiệt này thuận lợi ở điểm giảm thiểu những sự cố có thể dẫn đến sự gây nhiễm trong suốt quá trình lên men. - Vi khuẩn sinh acid lactic Mặc dù có khả năng sản sinh ra được acid với vai trò là sản phẩm trao đổi chất chính, nhưng chúng lại rất nhạy cảm với acid. Vì vậy, quy trình hướng tới sử dụng lượng lớn nguồn C, đồng thời trung hòa lượng nồng độ cao acid sinh ra, giữ pH trong khoảng từ 5,5-6. Vi khuẩn sinh acid lactic là những vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. Chúng cần một nguồn dinh dưỡng phong phú, gồm các vitamin, amino acid và cả những peptide nhỏ. Vì vậy nếu không khử trùng kỹ lưỡng các thành phần môi trường ban đầu sẽ rất dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy. Thông thường vi khuẩn acid lactic sử dụng nguồn C thông thường như glucose, fructose, lactose, maltose, sucrose. Chúng không sử dụng trực tiếp được tinh bột, tuy nhiên cũng có một vài chủng vi khuẩn lactic phân hủy được tinh bột trong quá trình sản xuất acid lactic. 3. GIỐNG SẢN XUẤT Cho đến nay những đặc tính di truyền học của vi khuẩn lactic đã được tìm hiểu rõ, cũng như những áp dụng kỹ thuật gen trong lĩnh vực này. Những phương thức này đã được phát triển theo Devos và Vaughan (1944), Frizsimons và cs. (1994), Wei và cs. (1995). Nhưng trên thực tế, mặc dù ứng dụng trong việc sử dụng hệ thống tái tổ hợp DNA đã được nghiên cứu hoàn chỉnh, việc sản xuất acid lactic trong công nghiệp vẫn còn tiến hành trên những phương pháp truyền thống, đó là sử dụng các chủng vi sinh vật đã được chọn lọc, kiểm tra bằng thực nghiệm. Người ta sẽ căn cứ vào năng suất tạo sản phẩm của vi sinh vật trên những nguồn vật liệu thô nhất định nào đó để có thể tìm ra những những chủng tối ưu cho để đáp ứng cho những nhu cầu trong công nghiệp. Đối với nguồn nguyên liêu thô là glucose, một số loài vi sinh vật có thể sử dụng được thuộc nhóm Lactobacillus, như Lactobacillus delbrueckii, cụ thể là Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii (Teuber, 1993; Hammes và cs., 1991). Những loài vi sinh vật này cũng có thể sử dụng luôn cả sucrose vì thế có thể tiến hành lên men trên đường sucrose hay rỉ đường, nhưng chúng không sử dụng được lactose. Một mặt khác, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus lại có thể dùng được lactose mà không dùng được sucrose, vì vậy được ứng dụng trong việc chuyển đổi những cơ chất chứa lactose ví dụ whey (nước sữa). Có những giống khác cũng thuộc loài vi sinh vật này lại không có khả năng phân cắt trên cơ chất galactose. Lactobacillus helveticus có thể phân cắt được lactose và cả galactose, không phân cắt được sucrose, vì vậy cũng được xem là một vi sinh vật hữu ích tiêu biểu khác trong

31

việc chuyển đổi trên cơ chất whey. Lactobacillus delbrueckii ssp. lactic thì có thể sử dụng được trên cả cơ chất chứa glucose, sucrose và lactose. Đối với cơ chất tinh bột, điều đáng nói ở đây là các loài vi khuẩn lactic không có khả năng phân hủy trực tiếp được tinh bột, cần có sự thủy phân tinh bột trước khi đưa thành cơ chất cho quá trình lên men. Việc chọn lựa sử dụng loại vi sinh vật nào trong trường hợp này còn phụ thuộc vào phương thức thủy phân tinh bột. Nếu sử dụng alpha hay beta amylase (từ đại mạch, hay malt), như chất xúc tác trong chuỗi đường hóa thông thường (ví dụ sản xuất ethanol), nguồn C chính phải là maltose. Những loài vi sinh vật có khả năng trong lên men maltose như Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, một vài giống Lactobacillus delbrueckii và một số chủng khác (Teuber, 1993). Nếu thực hiện quá trình đường hóa với enzyme alpha amylase hay glucoamylase, sản phẩm chủ yếu của quá trình thủy phân là glucose và glucose oligosaccharides, những chủng vi sinh vật nêu trên cũng có thể áp dụng trong trường hợp này. Đặc biệt với sự phát hiện ra chủng vi sinh vật có tên là Lactobacillus amylophilus (Nakamura và Crowell, 1979) và Lactobacillus mylovorus (Nakamura, 1981), có hoạt tính mạnh trong quá trình lên men với cơ chất tinh bột, và đã trở thành một giải pháp thay thế của quá trình lên men acid lactic trong công nghiệp (Cheng và cs.,1991; Zhang và Cheryan, 1994). Những thành viên của nhóm lactococci thì hiếm khi được sử dụng trong lên men acid lactic thương mại. Người ta đã có những cơ sở dựa trên nguồn cơ chất (nguyên liệu thô ban đầu) để tìm ra được chủng vi sinh vật thích hợp. Tuy nhiên, cho dù sử dụng nguồn nguyên liệu thô nào, thì chủng vi sinh vật được lựa chọn phải cho năng suất cao. Như đã đề cập ở trên, sự lựa chọn được thực hiện bằng một số thực nghiệm đơn giản và ước lượng sai số của phương pháp. Vì sản lượng còn phụ thuộc nhiều vào nồng độ H+ trong dịch lên men, nên có thể điều chỉnh tăng nồng độ acid lactic để tăng khả năng chuyển hóa thực hiện của các chủng vi sinh vật. Việc áp dụng những hợp chất hóa học có khả năng gây đột biến (ví dụ ethyl methane sulfonate) cũng được đưa ra để tạo ra các biến thể (thể đột biến) của chủng Lactobacillus delbrueckii (ATCC 9649) có khả năng chịu được nồng độ acid cao hơn chủng bình thường và cho năng suất lên men cao hơn (Demirci và Pômett, 1992). Một vấn đề nữa thường bắt gặp trong công nghệ sữa là sự cố gây nhiễm của nhiều loại bacteriophage khác nhau. Và tất nhiên người ta đã xác định nhiều phage gây nhiễm trong quá trình lên men acid lactic. Có những dấu hiệu cho rằng những phage độc có nguồn gốc từ giai đoạn prophase còn lại và tồn tại trong suốt một giai đoạn dài (ShimizuKadota và cs., 1983; Shimizu-Kadota và Tsuchida, 1984). Bằng nhiều thử nghiệm khác nhau, người ta đã đưa ra kết luận sơ bộ về tìm cách loại bỏ phage có thể khắc phục được prophage trong giống ban đầu. Tuy nhiên, cũng có nhiều người khác (như Teuber và Lemke, 1983) cho rằng không phải những phage ôn hòa lại đóng vai trò quan trọng trong việc gây nhiễm. Trong công nghiệp sữa, người ta đã nghĩ ra các phương pháp giải quyết như trung hòa các phage gây nhiễm hoặc là lựa chọn của giống có tính đề kháng phage (MataGilsinger, 1985; Teuber, 1993; Reed và Nagodawithana, 1995).

32

Theo quy luật, để có thể tạo ra những điều kiện có thể cho sinh sôi nảy nở của các chủng vi sinh vật tạo giống, đòi hỏi phải bảo quản mẻ vi khuẩn nuôi cấy trên những môi trường dinh dưỡng nhất định theo tiêu chuẩn, ví dụ môi trường nuôi cấy MRS. 4. SẢN XUẤT TRÊN QUY MÔ CÔNG NGHIỆP

Hình 12: Sơ đồ quá trình lên men acid lactic

Những thử nghiệm để hoàn thiện quy trình sản xuất acid lactic thương mại đã bắt đầu từ năm 1881, được đưa ra bởi Avery ở Littleton, USA. Mục đích nhằm để thay thế cho nguồn tartrates nhập khẩu, rồi được sử dụng trong làm bột nở bằng calcicum lactate. Mặc dù không được thuận lợi cho lắm, sự thay thế đầu tiên đã được thiết lập trong lĩnh vực công nghiệp bằng công nghệ sinh học. Năm 1895, một nhà máy sản xuất acid lactic bằng phương pháp lên men đầu tiên đã được xây dựng lên bởi A. Boehringer ở Ingelheim, Đức (Buchta, 1983). Phương thức sản xuất acid lactic bằng lên men cho ra những sản phẩm cạnh tranh được với phương pháp tổng hợp hóa học. Trong phương pháp tổng hợp hóa học: người ta tiến hành bằng phản ứng oxi hóa propene xúc tác bởi acid nitric và/hoặc nitrogen peroxide trong sự có mặt của oxygen, sinh ra alpha nitratopropinioic acid từ đó có thể được thủy phân cho ra acid lactic và acid nitric (Platz và cs.,1972; Boichard và cs.,1973). Một phương pháp khác của tổng hợp acid lactic bằng hóa học là thủy phân lactic acid nitrile (Vogt và cs., 1966), đạt được bằng phản ứng của acetaldehyde với HCN. Cả hai phương pháp tổng hợp hóa học và phương pháp lên men acid lactic đều gặp phải vấn đề trong quá trình tinh chế để đạt chất lượng theo những tiêu chuẩn đặt ra trong những ứng dụng khác nhau. Giai đoạn này đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định giá thành sản phẩm sau này. 4.1 Nguyên liệu thô

33

Ngoài khả năng giá thành chấp nhận được hay không, nguyên liệu thô ban đầu cũng đóng một phần quyết định ảnh hưởng đến quy trình tinh chế sản phẩm cần thiết sau này. Sự lựa chọn nguyên vật liệu phụ thuộc vào ứng dụng của sản phẩm. Giá thành sản phẩm acid lactic phụ thuộc vào nguyên liệu thô và quy trình tinh chế. Những nguồn nguyên liệu cơ chất mono hay disaccharide truyền thống thường sử dụng trong sản xuất acid lactic là: - Glucose (dextrose) và glucose syrup, những sản phẩm cuối của quá trình chuyển hóa tinh bột sử dụng alpha amylase và glucoamylase - Maltose, sản phẩm của quá trình chuyển hóa tinh bột sử dụng alpha amylase và beta amylase từ malt đại mạch hoặc là những nguồn khác. - Sucrose, sản phẩm cuối, sản phẩm trung gian (từ syrup, trái cây) và sản phẩm phụ (mật rỉ đường) từ củ cải đường và đường mía. - Lactose thành phần của whey, đây là nguồn cơ chất tự nhiên của hầu hết vi khuẩn lactic. Như vậy, tinh bột không được sử dụng bởi những vi khuẩn lactic thông thường, trừ Lactobacillus amylophilus và Lactobacillus amylovorus. Quá trình thủy phân tinh bột cần được tiến hành trước khi tiến hành lên men, phương pháp thủy phân có thể thực hiện bằng xúc tác hóa học hoặc bằng enzyme. Vì maltose là sản phẩm chính của quá trình này nên chỉ một số lượng nhỏ vi sinh vật có thể sử dụng trong quá trình lên men. Tương tự như sản xuất ethanol trong công nghiệp, sự hóa lỏng tinh bột và đường hóa đạt được bằng cách kết hợp alpha amylase của vi khuẩn gốc và glucoamylase từ nấm. Vì vậy các chế phẩm đường thu được từ nguyên liệu tinh bột thô khác nhau không khác nhau. Hydrol (dung dịch thu được sau khi chuyển tinh bột thành đường), sản phẩm phụ của sản xuất dextrose, cũng được dùng như nguồn nguyên liệu thô. Sucrose - lấy từ nguyên liệu thô cũng phù hợp làm cơ chất cho lên men acid lactic và rõ ràng chúng là nguồn cơ chất đầu tiên được sử dụng trong công nghiệp lên men. Hầu hết các chủng Lactobacillus lên men đồng hình có thể sử dụng nguồn sucrose, với Lactobacillus bulgaricus và Lactobacillus helveticus là các ngoại lệ đáng kể. Việc sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền mật rỉ đường cũng là một điều đáng quan tâm lớn. Có thể nói rằng, mật rỉ đường, sau khi được xử lý phù hợp, là một nguồn cung cấp carbon đáng kể, tuy nhiên cho năng suất thấp hơn và cũng khó tinh chế sản phẩm hơn sau này. Lactose, lấy từ whey cũng là một nguồn nguyên liệu quan trọng cho các chủng vi sinh vật. Tuy nhiên, cũng giống như mật rỉ đường, nó cần những công nghệ tốn kém cho việc tinh chế sản phẩm. 4.2 Quá trình lên men 4.2.1 Phương pháp calcium lactate cổ điển Nguoàn C vaø E + Nguoàn N + O2 + Caùc yeáu toá khaùc → Sinh khoái + Saûn phaåm + CO2 + H2O + Nhieät Người ta sử dụng nguyên liệu thô có chứa đường (glucose, sucrose) với nồng độ khoảng 120-180g/L. Bổ sung nguồn nitrogen, có thể là các hợp chất vô cơ có chứa N như

34

ammonia, dung dịch ammonia, ammonium sulfate hoặc ammonium phosphate cùng với các hợp chất hữu cơ có chứa N như dịch bắp ngâm, dịch chiết nấm men, peptone và một số digest protein khác, malt nảy mầm, cho hàm lượng N từ 1-10 g/L. Nếu không kể cả thành phần của hợp chất dinh dưỡng khác, thành phần khoáng (khoáng đa lượng) cũng được cung cấp bằng cách thêm vào phosphate và muối (như muối sulfate của magnesium, manganese hay sắt). Thông thường, những thành phần phức hợp (như dịch chiết nấm men, peptone,…) có tính quyết định đến kết quả nồng độ tế bào thu được (Monteagudo và cs., 1993). Sự tiệt trùng, khử nhiễm các thành phần của môi trường là rất cần thiết trong quá trình chuẩn bị nuôi cấy, lên men. Quá trình lên men được thực hiện trong các lò phản ứng với thể tích lò thường là lớn hơn 100m3. Một yếu tố quan trọng là trong quá trình lên men sản xuất acid lactic thường sinh ra những chất có thể gây ăn mòn. Cần phải có những cách thức chống sự ăn mòn trên vừa là để giữ gìn bảo vệ lò phản ứng, vừa ngăn chặn sự nhiễm vi sinh vật lạ cho dịch lên men. Trước đây, đối với những lò phản ứng có thể tích nhỏ, người ta thường làm các bể bằng bê-tông. Ngày nay, cũng làm bằng bê-tông nhưng với sơn lớp phủ ngoài thích hợp, người ta cũng dùng thép không rỉ để tránh được sự ăn mòn như đã nêu trên. Nhiệt độ phản ứng lên men được điều khiển trong khoảng hơn 45oC, cung cấp nhiệt phần lớn trong giai đoạn đầu, làm nguội ngay khi khi quá trình lên men toả nhiệt. Calcium carbonate dạng khan, nghiền vụn được thêm vào lúc bắt đầu hoặc sau đó trong suốt quá trình lên men để giữ cho nồng độ của acid lactic dạng tự do thấp đến mức có thể. Như đã đề cập ở trên, giá trị pH duy trì khoảng 5,5-6. Cấy giống được thực hiện bằng cách thêm những thể tích khoảng 10% môi trường nuôi cấy để duy trì được thành phần như môi trường ban đầu (RAUCH và cs., 1960). Sự bắt đầu lên men (khoảng 6h sau khi fetch) được kiểm soát bởi sự thoát ra của khí CO 2 từ calcium carbonate thêm vào, để ngăn chặn không khí vào hệ thống. Do đó, sự phát ra của khí CO2 từ quá trình hô hấp được ngăn chặn ở mức vừa phải. Việc áp dụng nước vôi sữa để trung hòa không cung cấp những điều kiện thuận lợi. Duy trì tương đối một nhiệt độ cao (50oC) cho Lactobacillus delbrueckii hay những chủng cùng loài khác tạo chiều hướng giảm bớt khả năng nhiễm khuẩn. Hoạt động lên men hoàn chỉnh sau 2-6 ngày, tùy thuộc nồng độ nguồn carbon cung cấp. Trong lên men calcium lactate, mức giới hạn nồng độ đường cao hơn được cho rằng có tính quyết định bởi tính tan được của calcium lactate. Người ta đã khẳng định rằng, nếu dùng một nồng độ đường cao hơn (khoảng 260 g/L) có thể khả thi trong lên men với liều lượng CaO tương ứng nhằm điều chỉnh pH khoảng 6,3 gây nên việc lắng xuống tiếp tục của calcium lactate. 99,6% chuyển đổi trong 3 ngày được thực hiện bằng phương thức này (Maslowski, 1988). Thông thường, về mặt lý thuyết, tỷ lệ chuyển đổi đạt được từ 85-95%. Khoảng 2% sản phẩm phụ là acid acetic và acid propionic. 4.2.2 Quá trình thu hồi và tinh sạch Quá trình miêu tả sự tinh chế và thu sản phẩm bằng phương pháp calcium lactate được đưa ra bởi Rauch và cs.(1960), nó phụ thuộc vào độ tinh sạch của nguyên liệu thô sử dụng lên men. Sử dụng đường tinh (dextrose, đường từ củ cải đường hay đường mía), dịch lên men được gia nhiệt để làm tan tất cả calcium lactate và tiếp theo là xử lý với acid sulfuric

35

(78%). Calcium sulfate tạo ra được loại bỏ qua quá trình lọc. Dung dịch thu được cho bay hơi (chân không). Lượng thạch cao còn dư kết tủa trong dịch acid lactic được lọc để loại bỏ cùng với các chất có màu mà có thể bị hấp phụ bằng carbon hoạt tính. Sự không tinh khiết cũng có thể bị gây ra bởi các ion kim loại nặng, trong trường hợp này sẽ được xử lý bằng hexacyanoferrate hoặc cho dung dịch qua cột trao đổi ion và xử lý bằng hydrogen peroxide hay potassium permanganate. Độ tinh khiết của dung dịch sản phẩm thu được có thể đạt tới 80%. Dịch lên men thu được từ lên men trên những nguyên liệu thô có chất lượng kém đòi hỏi những bước tinh chế nghiêm ngặt. Bao gồm giai đoạn tiền tinh chế (tinh chế sơ bộ) bằng cách lọc, sau đó là làm kết tinh calcium lactate, có acid sulfuric giúp phân hủy cộng thêm xử lý bằng nhựa resin trao đổi ion. Muốn đạt được độ tinh khiết cao hơn, có thể tiến hành lặp lại nhiều lần quá trình làm kết tủa và sử dụng acid sulfuric phân hủy calcium lactate. Những cải tiến khác cũng được đưa ra như sử dụng kẽm lactate hay magnesium lactate để thay thế. Đặc biệt trong trường hợp lên men sử dụng nguồn nguyên liệu thô ban đầu là carbohydrate như rỉ đường, thì sử dụng magnesium lactate đạt được một hiệu quả cao bởi vì nó cải tiến được đặc tính kết tinh (Bode, 1969). Theo tính toán, lượng calcium sulfate tạo ra và loại bỏ xấp xỉ lượng acid lactic sản xuất. Vì thế, vấn đề loại bỏ thạch cao thừa ngày càng trở nên quan trọng cùng với việc gia tăng hiệu suất lên men. Một phương pháp khác tinh sạch acid lactic đó là kết hợp sự ester hóa, (với methanol) và chưng cất những hợp chất ester dễ bay hơi được xem là bước phân tách có hiệu quả nhất để tạo ra những sản phẩm có độ tinh khiết cao (Schopmeyer, 1943; Bowmans Chem, Ltd., 1962; Sepitka và Gaertner, 1962). Sự ester hóa là quá trình ngược dòng đồng thời phân tách ester dễ bay hơi và kế sau đó ester hóa lại bằng nước trong giai đoạn thứ hai tạo ra acid lactic tự do và methanol được đưa vào lại hệ thống. Phương pháp này được cho rằng sản sinh ra được acid lactic với độ sạch tốt nhất không kèm theo một sản phẩm thải nào. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là cần có trang thiết bị đắt tiền, kỹ thuật hiện đại. Còn phương thức dùng ion trao đổi, cho đến nay chỉ mới sử dụng trong bước tinh chế, chủ yếu là để tách acid lactic khỏi dịch lên men (Kanazawa, 1977; Obara, 1989; Kulprathipania và Oroskar, 1991; Mantovani và cs., 1992; Mantovani và cs., 1992; Matsuda và Yoshida, 1992; Evangelista và cs., 1994). Các quy trình khác 4.2.3.1 Quy trình ammonium lactate Trong suốt quá trình lên men, pH của dịch được duy trì trong khoảng 5,5-6. bằng cách bổ sung lượng sodium carbonate hoặc sodium hydroxide, nhưng cũng cần phải cô lập sodium lactate tạo ra hiện diện trong dịch, đây cũng là một vấn đề đáng lưu ý. Người ta đã thử trung hòa acid lactic tạo ra bằng ammonia (Poznanski và cs., 1976; Stieber và cs., 1977; Jarry và Lamonerie, 1988). Ý kiến ban đầu có thể tạo ra ammonium lactate. Có thể thấy rõ rằng lượng dung dịch ammonium lactate có thể bị ester hóa rất thuận lợi và từ đó thu lại dễ dàng acid lactic từ lactic ester, giải phóng ammonia hoặc những hợp chất muối ammonium vô cơ hữu ích khác (Walkep và cs., 1991; Sepitka và Sepitkova, 1992; Cockrem và Johnson, 1993; Kumagai và cs., 1994). Theo sự khẳng định rõ ràng của Walkup và cs. (1991), dạng ammonium lactate khi phản ứng với một alcohol sẽ tạo ra 4.2.3

36

ester tương ứng, có thể được tách ra và sử dụng để tạo ra acid lactic sạch, giá rẻ, hoặc biến đổi thành acid acrylic sạch, giá rẻ. Công trình của Cockrem và Johnson (1993) là đã đưa ra được một danh sách các alcohol có thể ứng dụng. Còn với quy trình của Kumagal và cs. (1994), ông cho rằng sự ester hóa ammonium lactate được thực hiện tại nhiệt độ cao sẽ ảnh hưởng đến sự giải phóng và thu hồi lại ammonia. Quy trình của Sepitka và Sepitkova (1992) bao gồm lên men với nồng độ đường 200g/L bởi Lactobacillus delbrueckii. Giá trị pH giữ trong khoảng dưới 6,0 bằng cách thêm dung dịch ammonia. Rượu lên men được cho bay hơi để acid lactic đạt được nồng độ khoảng 50-60%, bằng cách xử lý với một lượng acid sulfuric phù hợp để giải phóng acid lactic và hòa lẫn một thể tích tương đối methanol. Nhiệt độ của toàn bộ quá trình không được vượt quá 100oC. Sản lượng acid lactic trong toàn bộ quá trình khoảng 95%, nghĩa là 90% phụ thuộc vào nguồn đường ban đầu. 4.2.3.2 Quy trình lên men liên tục Qúa trình lên men liên tục cho năng suất sản phẩm cao hơn và vì vậy chúng được thực hiện trong nhiều dạng khác nhau. Trong những thí nghiệm trước đây, người ta sử dụng huyền phù tế bào (Childs và Welsby, 1966) và cuối cùng thu hồi tế bào (Vick và cs., 1983). Hệ thống lên men nếu sử dụng với tốc độ dòng chảy cao, năng suất tăng lên khoảng 50g/L.h (Richter và cs., 1987). Không chỉ cho năng suất cao, phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với cơ chất whey. Một vài tác giả đã có những nguyên cứu về lên men whey bằng phương pháp lên men liên tục này như Boyaval và cs., 1987; Mehia và Cheryan và cs., 1987a; Aeschlimann và Von Stockar, 1990; Krischke và cs., 1991; Kulozik và cs., 1992; Boergardt và cs., 1994). Bên cạnh đó người ta cũng đưa ra những phương pháp khác sử dụng các quy trình kết hợp (Chmiel và Paulsen, 1991). 4.2.3.3 Ứng dụng của cố định tế bào Các nhà nghiên cứu trên thế giới cũng đã bỏ ra không ít thời gian để nghiên cứu phương pháp sản xuất acid lactic bằng hệ thống cố định tế bào (Linko và cs., 1984; Mehaia và Cheryan, 1987b; Boyaval và Goulet, 1988; Bassi và cs., 1991) nhưng chưa ứng dụng được trong sản xuất công nghiệp. 4.3 Những vi sinh vật khác ngoài vi khuẩn lactic Không chỉ có vi khuẩn lactic, người ta đã tìm ra một số lượng không nhỏ các chủng vi sinh vật khác cũng có khả năng sản xuất ra một lượng lớn acid lactic từ những nguồn carbon thông thường. Ví dụ như chủng Rhizopus. Trong luận án nổi tiếng của Foster (1949) “Chemical activities of Fungi”, ông đã đề nghị sử dụng Rhizopus cho sản xuất acid lactic thương mại. Loài này có thể chuyển hóa được những nguồn đường khác nhau trong môi trường lên men tổng hợp. Mặc dù ý kiến này đã được đưa ra từ lâu(Snell và lowery, 1964), việc đưa vào sử dụng kỹ thuật này đến nay vẫn chưa hoàn chỉnh. Gần đây có nghiên cứu khác về quá trình chuyển hóa tinh bột bằng Rhizopus oryzae bằng lên men một giai đoạn (Hang, 1990). Một số trường hợp khác người ta sử dụng ở dạng bào tử vi khuẩn để lên men sản xuất acid lactic. Như:

37

4.4

Sporolactobacillus inulinus: tạo ra được D-(-) acid lactic Bacillus coagulans

Chất lượng sản phẩm và ứng dụng Acid lactic có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp và đời sống - Technical-grade lactic acid (acid lactic dùng trong kỹ thuật) có màu từ vàng nhạt đến màu nâu tùy theo nồng độ của nó (20-80%): sử dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất ester làm dung môi và chất làm mềm dẻo. - Hầu như 80% acid lactic sản xuất ra được dùng trong công nghệ thực phẩm, làm các chất có vị chua và làm chất bảo quản. chúng được gọi chung là food-grade lactic acid. Tùy theo mỗi quốc gia, sẽ có những quy định về hàm lượng và chất lượng acid lactic sử dụng. Acid lactic sử dụng trong trường hợp này phải không màu, chứa tối thiểu 80% acid lactic. Nhờ có vị chua dễ chịu, acid lactic cũng được bổ sung vào các loại đồ uống đóng chai, đóng hộp, nước hoa, nước ép trái cây, trong mứt, bánh kẹo, trong các sản phẩm đồ hộp, trong làm bánh để làm bột chua, bột nhão. - Pharmacopocia-grade lactic acid: chứa hàm lượng acid lactic 90%, chất khác khoảng 0,1%, phải không màu, không mùi, được dùng làm các chất pha chế sản xuất dược phẩm hoặc những dẫn xuất khác của acid lactic (ví dụ calcium lactate). - Plastic-grade lactic acid: cần phải nguyên chất, không màu và hàm lượng các chất khác dưới 0,01%. Được sử dụng trong sản xuất sơn, véc ni, các chất thấm như polymer. Tiêu chuẩn chất lượng quan trọng của acid lactic là khả năng bền nhiệt. Trong những thập nên gần đây, sản lượng sản xuất acid lactic luôn duy trì ổn định, Hình 13: Mức tiêu thụ acid lactic có thể ước lượng lương acid sản xuất được trên thế giới năm 2005 khoảng 50000 t/a, chiếm khoảng 2/3 lượng sản phẩm của công nghệ lên men.

38