COURS AGP_IAA

NOUVEAUX HORIZONS POUR L’AMELIORATION DES PLANTES

Filière Industries Agricoles et Alimentaires (IAA)

Abderrahim Lazraq

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INTRODUCTION
Avec les nouvelles biotechnologies, les sélectionneurs poursuivent les mêmes objectifs qu'auparavant : disposer de variétés végétales résistantes aux stress, aux maladies, etc., permettre des techniques culturales simples et économes, fournir aux agriculteurs des plantes d'un niveau de productivité élevé et régulier, cultiver des plantes mieux adaptées à leur utilisation ou à leur transformation. Les sélectionneurs ont également des objectifs qui leur sont propres : disposer de ressources génétiques élargies, pouvoir introduire les gènes les plus intéressants de façon plus précise, rapide et efficace. Enfin, les biotechnologies ont aussi pour but d'améliorer les conditions liées à la production de semences, préalable à toute culture. Ce cours pédagogique a pour objectif de présenter les différentes méthodes classiques et biotechnologiques consacrées à l'amélioration des plantes et les moyens mis en œuvre.

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PARTIE I AMELIORATION GENETIQUE DES PLANTES
Méthodes conventionnelles (Classiques)

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Introduction Aujourd'hui, l'amélioration végétale consiste à créer de nouvelles variétés à partir des variétés existantes, en les croisant entre elles et en sélectionnant les meilleures plantes issues de ces croisements. Des générations de sélectionneurs ont fait de la création variétale le fruit de l'observation, de la patience et de la passion. L'évolution des techniques et des connaissances permet aux sélectionneurs d'accroître leur efficacité, de gagner du temps sur les cycles végétatifs et de s'entourer d'outils de mesure et d'analyse au champ et au laboratoire pour confirmer leur choix. Ces méthodes issues du domaine de la statistique, de la biologie, de la biochimie et de la biotechnologie concernent l'ensemble de la sélection végétale. Mais le travail du sélectionneur dépendra toujours de l'espèce végétale à améliorer, de sa biologie, de son mode de reproduction et de ses utilisations. La diversité des schémas de sélection est donc celle des espèces et de la vie. Connaître les méthodes de sélection, c'est comprendre les ressources, les enjeux, les perspectives et mesurer l'importance des progrès acquis dans la création variétale. C'est aussi lire une page de l'histoire des hommes et des plantes.

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Chapitre I : fonctions et principes de l’amélioration génétique des plantes I- Historique et évolution de l’amélioration des plantes La sélection végétale a commencé lorsque l’Homme a appris à choisir des plantes capables de le nourrir et de nourrir son bétail. Les méthodes de sélection pratiquées par l’Homme aux débuts de la domestication des plantes semblent être primitives par rapport à celles utilisées de nos jours par les sélectionneurs. Les formes modernes de l’amélioration des plantes sont apparues aux XIXème siècle après un long processus d’élaboration d’une méthode de sélection. Domestication inconsciente → jardinage → échange → codification de l’agronomie

→ maîtrise des descendances renforcée par les premières lois génétiques →
développement de l’amélioration des plantes en tant que science et éruption des biotechnologies. Les étapes de la domestication des plantes

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L'exemple du maïs L'histoire du maïs est étroitement liée à celle de l'humanité. Grâce au travail de l'homme, cette plante a évolué et son aire de culture s'est développée. Le maïs résulterait de la domestication du téosinte par l'homme. Le téosinte, proche génétiquement du maïs, est cependant différent sur le plan morphologique. Le téosinte présente un tallage abondant, un épi de petite taille et une sensibilité à l'égrenage. Les premiers maïs, datés de - 7 000 ans, ont été découverts au centre du Mexique. Les civilisations indiennes ont effectué sa domestication. Un épi de maïs mesurait alors environ 2,5 cm et les rendements supposés atteignaient 0,12 t/ha. Les caravelles des conquistadors apportent le maïs dans le sud de l'Europe, où il se développe en populations adaptées à chaque terroir. Avec la redécouverte des lois de Mendel à la fin du 19e siècle et la mise en évidence du phénomène d'hybridation au début du 20e siècle, naît la sélection des plantes, telle que nous la connaissons aujourd'hui. Le maïs est l'espèce dans laquelle les premiers hybrides ont été créés. Ces variétés hybrides sont plus vigoureuses que les populations, c'est le résultat de l'hétérosis, appelé également vigueur hybride. Elles ont permis notamment l'extension des zones de culture du maïs grâce à une meilleure tolérance au froid et une plus grande précocité. Ces hybrides résultent du croisement entre des lignées américaines de maïs à grains dentés et des lignées européennes à grains cornés. Les premières lignées cornées proviennent de populations locales telles que la population Lacaune, qui était cultivée dans le Sud-Ouest.

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Les repères historiques de la sélection Progrès des connaissances 1676. Découverte du rôle des organes sexuels chez les végétaux par MillingtonGrew. 1880. Visualisation des chromosomes par Strasburger-Boveri, et mise en évidence de leur implication dans la division cellulaire. 1900. Mise en application des lois de Mendel sur l'hérédité. Ses travaux sur le croisement de deux variétés de petits pois définissent les règles de base de la génétique. C'est la naissance de la sélection des plantes. 1902. Découverte de la totipotence des cellules végétales par Haberland. Un tissu végétal est capable de régénérer une plante. 1908. Découverte de l'intérêt des hybrides par Shull sur le maïs. Le croisement de deux lignées permet d'obtenir un hybride qui exploite l'hétérosis. 1953. Description de la structure en double hélice de l'ADN par Watson et Crick. 1960. Découverte du code génétique par Crick, Nirenberg, Mathaeri et Ochoa. 1965. Découverte des enzymes de restriction par Aber, Smith et Nathans. Ces protéines coupent l'ADN au niveau de sites particuliers. 1977. Découverte du transfert de gènes par des agrobactéries, bactéries du sol pathogènes de nombreuses espèces végétales, par Schell. Il a montré que la virulence de ces bactéries est due à un transfert de gènes de la bactérie vers les cellules végétales. Progrès des techniques Les progrès des connaissances ont permis ensuite de mettre au point les techniques. Voici quelques exemples d'application : 1911. Notion de liaison génétique par Morgan. Il démontre que les gènes sont disposés de façon linéaire sur les chromosomes et que de plus, lorsqu'ils sont situés sur le même chromosome, ils sont transmis à la descendance comme une seule unité. On dit qu'ils sont liés. 1935. Première carte génétique partielle du maïs par Emerson. 1950. Premières techniques de culture in vitro. Il s'agit de la technique de multiplication végétative, développée par Morel et Martin, sur la pomme de terre. 1961. Illustration des principes d'analyse des locus impliqués dans la variation des caractères quantitatifs, par Thoday. 8

1964. Premières cultures de cellules sexuelles mâles chez le Datura innoxia, par Guha et Maheshwari. Elles ouvrent la voie à la production de plantes haploïdes. 1975. Description de la méthode de Southern, du nom de son inventeur. Le principe de la technique repose sur l'hybridation de l'ADN avec une sonde d'ADN marquée. 1978. Premières fusions de protoplastes, par Melchers. Elles permettent de s'affranchir partiellement de la barrière entre espèces. 1983. Premiers tabacs transgéniques obtenus en même temps par une une équipe belge et une équipe américaine.

I- Définition
L'amélioration des plantes a pour but de créer de nouvelles variétés à partir de la diversité existante. Elle consiste à croiser deux plantes choisies pour leurs caractères intéressants et complémentaires afin de les réunir dans une seule. Par le choix des meilleures plantes dans la descendance, les sélectionneurs aboutissent après un long travail d'épurations successives à la création d'une nouvelle variété. La sélection à ses débuts était basée surtout sur le jugement du sélectionneur et sur sa capacité à identifier les génotypes supérieurs. De nos jours, et avec le développement spectaculaire des sciences biologiques, la sélection végétale est devenue plus une science qu’un art, puisqu’elle s’appuie sur les lois de la génétique et sur l’essor biotechnologique qui permettent aux sélectionneurs de raisonner le choix des génotypes.

L’introduction de nouvelles espèces

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Les origines des principales plantes cultivées

La sélection est à l'origine de l'implantation durable de nombreuses espèces, permettant ainsi d'offrir à chaque région la possibilité de disposer d'une grande diversité botanique de cultures. Au Maroc, de nombreuses productions végétales devenues importantes ont des origines géographiques très lointaines, comme par exemple la pomme de terre, originaire du Pérou ou le maïs de l'Amérique Centrale.

III- Objectifs
Les objectifs de la sélection sont nombreux. Généralement, le premier critère évoqué est la productivité. La productivité dépend de nombreux facteurs. Elle peut être le résultat de la réduction des facteurs limitants du rendement, mais le potentiel de productivité peut également être accru par une amélioration de la physiologie des plantes. Les espèces végétales sont également plus ou moins plastiques C’est un objectif ambitieux, car il vise la création de cultivars «cutivated varieties » ayant un ensemble de caractéristiques leur permettant d’être cultivés avec profit par le producteur et d’être appréciés par le consommateur. D'autre part, on demande de plus en plus à l'agriculture de respecter l'environnement, de contribuer à des activités industrielles et de produire des molécules à usage pharmaceutique. La recherche prend déjà en compte ces nouveaux critères afin de permettre par exemple la production d'énergie, de substances transformées à usage non alimentaire, de vaccins ou de médicaments. 1- Pour le producteur : a) augmentation du rendement (aspect le plus important en amélioration des plantes) Rdt grain + Rdt biomasse b) Efficacité de la production ♦ Réduction de la hauteur : faciliter la récolte (sorgho) ♦ Résistance à l’égrenage (soja) ♦ Résistance à la verse (blé) diminution des frais culturaux et de la pénibilité (ç.a.d mécanisation) 10

c) Adaptation : Aptitude d’une plante à s’adapter à une grande gamme d’environnement en modifiant certaines de ses caractéristiques morphologiques ou physiologiques. ♦ Résistances aux maladies, insectes et ravageurs (économie) ♦ Résistance aux froid, sécheresse et hautes températures (Précocité) ♦ Résistance aux sols acides et salins. 2- Pour le consommateur : d) Amélioration de la qualité : Elle dépend de l’attitude des gens utilisant le produit final. ♦ Qualité boulangère (blé). ♦ Augmentation du taux et de la qualité des protéines des céréales (blé, maïs). ♦ Couleur, texture, forme et taille du fruit. ♦ Goût, …etc. (tomate, pomme PdT).

L’amélioration de la productivité
Evolution des rendements du blé

Accroissement des rendements : La sélection a permis une augmentation du rendement pour la quasi totalité des productions végétales pour lesquelles la sélection a eu lieu. Cette progression de la productivité est due non seulement au progrès génétique, mais également à

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l'évolution des techniques culturales : traitements, fumures, préparation des sols et doses de semis ... Régularité des récoltes et diminution des frais culturaux : Le progrès génétique a permis de rendre les plantes plus résistantes au froid ou à la sécheresse, de réduire le coût de l'installation du peuplement des betteraves (suppression du démariage) avec l'arrivée de la monogermie.

L’adaptation des plantes au milieu
La sélection a permis d'étendre la zone de culture des espèces en les adaptant à des conditions climatiques nouvelles comme le froid et la sécheresse ou d'autres stress climatiques comme la verse due au vent et l'inondation.

L’amélioration qualitative des produits
L'évolution de la teneur en glucosinolates de la collecte de colza

Une grande partie des plantes cultivées est transformée avant utilisation. Les produits récoltés doivent présenter des aptitudes de plus en plus précises, au transport, à la conservation, à la transformation et à des utilisations finales parfois diverses.

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Chapitre II : Reproduction chez les plantes Il existe deux types de reproduction : La reproduction sexuée La reproduction asexuée

→ Amphimixie → Multiplication végétative → Apomixie.

I- Reproduction sexuée : Caractérisée par la fusion de deux gamètes ♂ et ♀ conduisant à la formation de l’embryon : 1- morphologie d’une fleur :

2- type de fleurs : La fleur a quatre organes : - Pistil “♀” : Ovaire + Style + Stigmate. - Etamine “♂” : Anthère + filet. - Pétales et sépales.


Fleur complète : les 4 organes floraux sont présents.

 Fleur incomplète : 1(ou plus) des 4 organes est absent.  Fleur parfaite : porte l’étamine et le pistil dans la même fleur. 13

 Fleur imparfaite : si l’un des deux organes manque ou non fonctionnel.  Fleur staminée : ou fleur ♂, si elle ne porte pas de pistil.  Fleur pistillée : ou fleur ♀, si elle ne porte pas d’étamine. 3- Gamétogenèse : (revoir vos cours antérieurs) La méiose assure la production de cellules reproductrices, les gamètes. Le pollen est le gamète mâle (Microsporogenèse), l'ovule le gamète femelle (Mégasporogenèse). Dans le noyau des cellules, les chromosomes d'un individu sont associés par paires, ce sont des chromosomes homologues. L'individu est diploïde (2n). A l'issue de la méiose, les gamètes sont haploïdes (n), ils ne possèdent qu'un seul chromosome issu de chacune des paires de chromosomes homologues. La répartition de ces chromosomes étant aléatoire, les gamètes ne possèdent donc pas tous la même information génétique. Une cellule diploïde possède deux copies d'un même gène, une sur chaque chromosome de la paire d'homologues : ce sont les allèles. Lors de la séparation des chromosomes homologues par méiose, il y a également séparation des allèles. Chaque gamète ne peut recevoir que l'un ou l'autre des deux allèles d'un même gène. 4- Pollinisation et fécondation : (revoir vos cours antérieurs) Les descendants par croisement ne sont pas identiques à leurs parents. Cette diversité est une conséquence de la reproduction sexuée. La fécondation est l'union d'un gamète mâle et d'un gamète femelle. Celle-ci réunit les deux noyaux haploïdes et donne naissance à un œuf diploïde. L'œuf, puis la nouvelle plante, possède la même quantité d'information génétique que ses deux parents et les nouvelles paires de chromosomes homologues présentent donc des allèles issus du pollen et des allèles issus de l'ovule. Rq : Le transfert du grain de pollen des anthères aux stigmates fait appel à plusieurs vecteurs : Vent : anémophile ; Insecte : entomophile ; Eau : hydrophile ; Oiseau : ornitophile. 5- Modes de reproduction de l’espèce :

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Les stratégies de S! dépendent du mode de reproduction de l’espèce. Les espèces végétales se perpétuent selon trois modalités principales :  Par autofécondation : espèces autogames ;  Par fécondation croisée : espèces allogames ;  Par reproduction végétative à l’aide d’organes de reproduction très variés : tubercules, stolons, boutures, greffes, …etc. 5.1- mécanismes de l’autogamie :

Lorsque l’autopollen est utilisé, on parle d’autofécondation ou d’autogamie.  Fleurs ne s’ouvrent pas : (autogamie stricte) : sp. Cléïstogames.  Fleurs s’ouvrent après fécondation : (blé, orge, etc.) Cependant, il peut se produire chez ces espèces autogames un croisement naturel pouvant atteindre un taux de 4 à 5 %, (autogamie prépondérante). Ce taux peut varier selon les conditions climatiques, la variété, la vitesse et la direction du vent durant la pollinisation et enfin la population des insectes présents (types et nombre).

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 Détermination du taux de croisement naturel :

Deux variétés pures pour différentes formes d’un caractère facile à reconnaître et à héritabilité simple : Entourer les plantes ayant le caractère récessif de plantes ayant le Les semences récoltées sur plantes récessives sont semées et le % caractère dominant. de plantes montrant le caractère dominant est déterminé. 5.2- mécanismes de l’allogamie :

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Lorsque l’allopollen est utilisé, on parle de fécondation croisée ou d’allogamie. Dans la nature, la plupart des espèces sont allogames, la pollinisation est généralement anémophile ou entomophile. Les mécanismes de la fécondation croisée : a) séparation des sexes dans l’espace :

-

Plantes monoïques : les inflorescences ♂ et ♀ sont séparées, mais situées sur une même plante : maïs, melon, noyer, concombre, etc. Plantes dioïques : les sexes sont séparés sur des plantes ♂ et des plantes ♀ : chanvre, houblon, palmier, dattier, etc.

b) séparation des sexes dans le temps : Lorsque les organes sexuels n’arrivent pas à maturité en même temps sur la même fleur, on parle de dichogamie (2 cas) Si la partie ♀ de la fleur est prête avant la libération des grains de Si la partie ♂ de la fleur est mature avant la partie ♀ : protandrie : pollen : protogynie : (avocatier, etc.) (carotte). c) barrières morphologiques : Chez certaines légumineuses, le stigmate est protégé par une colonne staminale formée par des filets soudés entre eux. L’ouverture de cette colonne sous le poids des insectes (abeilles) met les stigmates en contact avec l’allopollen attaché aux corps de ces insectes, ainsi la fécondation croisée est assurée (luzerne). d) stérilité et auto-incompatibilité : stérilité : organes reproducteurs non fonctionnels : pistil ou étamine Auto-incompatibilité : absence d’aptitude pour une plante à donner mal formés, pollen ou ovule non fonctionnels. des semences (graines) lorsqu’elle est autofécondée, bien qu’elle puisse 17

donner des semences normales par la fécondation croisée. Son pollen est actif sur une autre plante.

II- Reproduction asexuée :
Multiplication végétative, Apomixie. 1) Multiplication végétative : Certaines parties végétatives de la plante sont utilisées pour reproduire la plante. Ce mode de reproduction est préféré quand : La production de semence est très réduite ou absente ; La multiplication à travers la semence peut induire une variabilité

génétique non voulue. Principales modalités : Tubercule : pomme de terre ; Rhizomes (tiges souterraines) : houblon ; stolons : fraisier ; bulbes : ail, oignon ; marcottes : figuier, vigne ; greffage : agrumes, poirier, etc.

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Chapitre III : Incompatibilité et stérilité I- Incompatibilité : Il existe deux types principaux d’incompatibilité pollinique : Incompatibilité gamétophytique ; Incompatibilité sporophytique.

1) incompatibilité gamétophytique : Déterminée par la nature haploïde du pollen ; Un gène de stérilité à un locus « S » existe sous plusieurs allèles : s1, s2, s3, s4,.….sn. Si l’un des allèles du stigmate est identique à l’allèle du pollen, il y a inhibition, et le tube pollinique après germination, ne pénètre pas dans le style. 2) incompatibilité sporophytique : Le pouvoir fécondant du pollen est sous l’action du génotype (2n) de la plante dont il est issu, et non de son génotype haploïde. Exp. Un grain de pollen s 1 provenant d’une plante s1s2 ne pourra pas féconder une plante s1s2 ou s2s3, mais fécondera une plante s3s4. Dans ce système, on peut trouver aussi des relations de dominance ou de compétition entre les allèles « S » qui peuvent déterminer lequel des allèles donnera au grain de pollen sa compatibilité ou son incompatibilité. Exp. Si on croise une plante s1s2 (♀) avec une plante s1s3 (♂) ; • • Cas de l’incompatibilité gamétophytique : s3 est bien compatible. Cas de l’incompatibilité sporophytique : Si s1 est dominant sur s3 chez le ♂, s3 se comportera comme s1 et, par Si s3 est dominant sur s1 chez le ♂, s1 se comportera comme s3 et, par conséquent, le croisement s1s2 X s1s3 sera incompatible. conséquent, les deux allèles s1 et s3 seront compatibles.

N.B : l’incompatibilité peut être utilisée pour faciliter les croisements entres lignées auto-incompatibles et produire des hybrides. 19

II- Stérilité mâle : Elle se manifeste par l’absence de pollen fonctionnel ou l ‘avortement des étamines. Déterminisme génétique de la stérilité mâle : 1- stérilité mâle génique : Elle est contrôlée par l’action des gènes spécifiques. Un seul gène récessif (ms) contrôle la stérilité mâle génique. msms (♂ stériles) X MsMs (♂ fertiles) «♀» «♂» F1 : 100% ♂ fertiles : Msms • Msms ⊗ → F2 : ¼ MsMs ; ½ Msms ; ¼ msms Population : ¾ ♂ fertiles (Ms-) + ¼ ♂ stérile (msms). • Conservation de la lignée mâle stérile :

msms X Msms → F1 : ½ msms ♂ S + ½ Msms ♂ F (supprimé grâce à des gènes marqueurs). Rq : La stérilité mâle génique est peu utilisée pour la production commerciale de variétés, par contre, elle est très utilisée en S ! pour obtenir un brassage génétique. 2- stérilité mâle nucléo-cytoplasmique : Elle dépend de l’interaction entre un cytoplasme particulier et un gène particulier. Un cytoplasme stérile est représenté par « S » et un cytoplasme fertile est représenté par « F ». Un gène Rf (restaurateur de la fertilité) restitue la fertilité au cytoplasme stérile. • • • • cytoplasme « F » + Quelque soit la combinaison génique → Fertile. // // // «S»+ «S»+ «S»+ RfRf Rfrf rfrf

→ Fertile. → Fertile. → Stérile.

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Exp. :

RfRf

S

X

rfrf

F

F1

Rfrf

S

♂ fertile

RfRf

Rfrf

rfrf

S ¼ ♂ “F” ½ ♂ “F”

S ¼ ♂ “S”

S

Rq: Le cytoplasme est toujours déterminé par la femelle. La stérilité mâle est utilisée parles sélectionneurs chez les plantes autogames et allogames pour faciliter les croisements naturels. D’ailleurs, chez les plantes autogames, la stérilité mâle entraîne l’ouverture des fleurs pour permettre au pollen étranger de s’y introduire et d’assurer la pollinisation.

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Chapitre IV : Variation génétique et amélioration des plantes L’amélioration des plantes est la recherche d’un gain génétique, or le progrès en S ! ne peut intervenir que si le matériel végétal disponible présente une variabilité génétique. I- Nature de la variation génétique : 1) Génétique mendélienne (G. qualitative) : • • Caractères facilement identifiables, mais difficilement mesurables. Exp. Couleur de la fleur. Caractères contrôlés par un faible nombrent de gènes dont les effets sont peu ou pas influencés par l’environnement. (voir cours de G. mendélienne). 2) Génétique quantitative : • • • • Caractères dont la variation est mesurable : exp. Rdt, taille, …etc. Caractères contrôlés par un nombre important de gènes à effets cumulatifs (dont on ne peut déceler les effets individuels). Une grande partie de la variabilité observée pour la plupart de ces caractères est due à des effets de l’environnement. Caractérisée par une variation continue « gamma continue ». Exp. Nilson-Ehle, en 1910, avait développé un modèle permettant d’illustrer l’hérédité quantitative :

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Exemple de ségrégation transgressive
P1 (6R)
R1R1R2R2R3R3 Couleur rousse très foncée X

P2 (0 R)
r1r1r2r2r3r3 couleur blanche

F1
R1r1R2r2R3r3 Roux intermédiaire

Autofécondation
F2
(6R) 1/64 R1R1R2R2R3R3 6/64 (5R) (4R) (3R) R1r1R2R2R3R3 R1r1R2r2R3R3 R1r1R2r2R3r3 R1R1R2r2R3R3 R1r1R2R2r3R3 R1R1R2r2r3r3 R1R1R2R2R3r3 R1R1R2r2R3r3 R1R1r2r2R3r3 15/64 R1R1R2R2r3r3 20/64 R1r1R2R2r3r3 R1R1r2r2R3R3 R1r1r2r2R3R3 r1r1R2R2R3R3 r1r1R2R2R3r3 r1r1R2r2R3R3 (1R) (0R) R1r1r2r2r3r3 1/64 r1r1r2r2r3r3 6/64 r1r1R2r2r3r3 r1r1r2r2R3r3

(2R) R1R1r2r2r3r3 r1r1R2R2r3r3 15/64 r1r1r2r2R3R3 R1r1R2r2r3r3 R1r1r2r2R3r3 r1r1R2r2R3r3

Conclusion : en autofécondant la F1, d’autres phénotypes, en dehors de l’intervalle des parents sont crées. Ces phénotypes de couleur plus foncée ou plus claire que celle des parents sont le résultat d’une combinaison, dans certains individus, d’allèles favorables ou d’allèles non favorables pour la couleur rousse. C’est le résultat d’une ségrégation transgressive qui est généralement exploitée par les sélectionneurs pour la création de variétés supérieures à partir de croisements de variétés à valeurs intermédiaires.

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II- Modes d’actions des gènes : Les modalités de l’hérédité des caractères polygéniques dépendent des relations entre les gènes qui les contrôlent. Ces relations peuvent être de trois natures définissant ainsi trois types d’effets génétiques : 1) additivité : la valeur phénotypique = la valeur phénotypique moyenne. aa Aa AA Aa = ½ (AA + aa)

Exp. Aa = 0; AA = 2; Aa = 1. Chaque gène renforce l’effet de l’autre (effets cumulatifs). 2) dominance : C’est l’ecart ou la déviation par rapport à l’additivité. aa dominance complète : Aa AA Aa = AA Exp. Aa = 0 ; AA = 2 → Aa = 2.

aa

dominance partièlle : Aa AA AA

aa + AA < Aa < AA 2

La valeur de l’hétérozygote « Aa » se trouve quelque part entre la moyenne des parents et la valeur du parent dominant. Exp. Aa = 0 ; AA = 2 ; Aa = 1,5.

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-

superdominance :

aa

AA

Aa Aa > AA

Exp. Aa = 0 ; AA = 2 ; Aa = 3. 3) épistasie : C’est l’interaction entre les gènes non alléliques. Dans ce cas, les gènes sans effets individuels, auront un effet s’ils sont combinés. Exp. Aabb = 0 ; aaBB = 0 ; A-B- = 4. Résumé: aa AA Echelle des « valeurs »

Aa Additivité

Aa D.P

Aa D.T

Aa Superdominance

Variation de la valeur de l’hétérozygote
La représentation paramétrique suivante illustre les différents modes d’action des gènes dans le cas d’une interaction intra-locus :

Génotypes AA Aa aa

Valeur α + 2u α + u + βu α

α est la valeur de base de « aa ». La substitution de “a” dans “aa” par “A” ajoute une valeur u + βu à α, et la substitution des 2a dans “aa” par 2A ajoute une valeur de 2u.

Tout dépend de la valeur de β, niveau de dominance : aa AA

1 - β = 0 : additivité : Aa = α + u + 0u = α + u = ½ (α + α + 2u ) = ½ (val (aa) + val (AA)). 2- β = 1 : dominance complète : Aa = α + 2u = valeur de AA. 25

α + u + βu 3- 0< β <1 : dominance partielle : α + u < Aa < α + 2u. 4- β > 1 : superdominance : Aa (α + u + βu) > AA (α + 2u).

III- Importance des effets de vigueur liés à l’état hétérozygote (Hétérosis) ou d’une dépression de consanguinité (Inbreeding) : Ces deux phénomènes généralement liés ont une importance essentielle et déterminent généralement le type de variété recherchée. 1- Inbreeding : Dans une population hétérozygote, l’inbreeding se traduit par une augmentation de la fréquence des homozygotes. Il existe plusieurs formes d’inbreeding : L’autofécondation, les croisements entre pleins-frères (Full-Sibs : FS) et demi-frères (Half-Sibs : HS) ou entre individus proches par parentés. Les pleins-frères ont les deux parents en commun alors que les demi-frères ont un seul parent en commun. Exp. A X B D&E BXC F D et E sont des pleins-frères D et F ou E et F sont des demi-frères

Rq : L’autofécondation est la forme la plus poussée d’inbreeding dans la mesure où elle conduit rapidement l’homozygotie totale.

Evolution de la fréquence des homozygotes et des hétérozygotes

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Génération Parents HF1 (S0) F2 : (S1) F3 : (S2) F4 : (S4)

Evolution des fréquences de génotypes (1 gène avec 2 allèles) AA X aa 1 Aa
1/4 AA 1/2 Aa aa 1/4

Fréq. Fréq. Hétéro. Homo. 0 100 % 50 % 25 % 100 % 0% 50 % 75 %

1/4 AA + 1/8 AA = 3/8

1/4 Aa

3/8 = aa 1/8 + aa 1/4

. . .

3/8 AA + 1/16 AA = 7/16

. . .

1/8 Aa

. . .

7/16 = aa 1/16 + aa 3/8

. . .

12.5 % 87.5 %

. . .

. . .

S0, S1, … représentent respectivement la population de départ (Aa), les populations après 1,2, … générations d’autofécondation. Après chaque génération d’autofécondation, l’hétérozygotie est réduite de moitié. Le pourcentage des individus homozygotes pour un locus après n générations d’autofécondation d’un individu hétérozygote pour ce locus, ainsi que pour g loci est donné sur le tableau suivant : Fréquence des 2 types génétiques après n générations Nombre de locus d’autofécondation hétérozygotes au départ Homozygotes Hétérozygotes 1 g 2n-1/2n [(2n-1)/2n]g
Homozygotes pour tous les gènes

1/2n (1/2n)g
Hétérozygotes pour tous les gènes

Rq : lorsqu’une plante est homozygote pour un gène, elle ne l’est assurément pas pour les autres, car la plupart des caractères à caractères agronomiques sont contrôlés par plusieurs gènes. Cependant, on estime qu’une dizaine de générations d’autofécondation aboutie à un niveau d’homozygotie suffisant en pratique pour assurer la stabilité et l’homogénéité des descendances (lignées pures).

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D’autre part, l’inbreeding se traduit également par une perte de vigueur (diminution de la hauteur, du poids total, de la production des graines, de la résistance au maladies, etc.), cette perte de vigueur est appelée « dépression de consanguinité ». ce phénomène est surtout marqué chez les plantes allogames. Pour les plantes autogames, il n’est pas apparent et ces plantes peuvent être maintenues à l’état homozygote sans perte de vigueur en raison d’une hérédité essentiellement de type additif. • causes de la dépression de consanguinité : expression de gènes généralement récessifs à effets létaux qui étaient jusqu’alors masqués à l’état hétérozygote. Suppression des effets de superdominance (état hétérozygote).

2- Hétérosis : L’hétérosis est un phénomène génétique opposé à celui de la dépression de consanguinité. Définitions :  c’est la différence (la supériorité) de l’hybride F1 par rapport à la moyenne des parents.  De point de vue pratique, c’est la supériorité de l’hybride F1 par rapport au meilleur parent. L’hétérosis se traduit par une augmentation de la hauteur, du volume racinaire, de la taille des feuilles et de l’épi, du nombre et de la taille des graines, de la résistance aux maladies, de la précocité, etc. a) explication de l’hétérosis : • théorie de la superdominance : elle se base sur la supériorité de l’hétérozygote Aa par rapport aux homozygotes. Exp. Aa > AA ou aa. • Théorie de la dominance complète : l’accumulation des gènes dominant dans la F1 peut fournir une explication de l’hétérosis. Exp. ♀ (AAbbcc) X ♂ (aaBBCC) Valeur 1 valeur 2 28

F1 (AaBbCc) Valeur 3 b) utilisation de l’hétérosis : L’hétérosis est à la base de la création des hybrides chez différentes espèces végétales cultivées. La supériorité de l’hybride par rapport aux souches parentales a poussé plusieurs sélectionneurs à en développer chez le maïs, le sorgho, la tomate et d’autres espèces végétales. IV- Origine de la variabilité : Dans une population de blé par exemple, toutes les plantes ne sont pas identiques sur le plan phénotypique. Elles peuvent être différentes par la hauteur, la date d’épiaison, le poids, le nombre d’épis, etc. on dit que la population est variable. Cette variabilité a deux origines : une environnementale et une héréditaire ou génétique. 1- variabilité due à l’environnement : Une variété de maïs adaptée aux conditions de culture en Europe, par exemple, ne sera pas forcement adaptée au Maroc, le milieu étant différent. Une variété d’orge très productive dans un sol fertile ne le sera probablement pas dans un sol très peu fertile. Tous ces exemples montrent que l’environnement peut contribuer à la variabilité observée dans une population végétale. Tous les facteurs autres que génétiques constituent l’environnement. La température, l’eau, les insectes, les agents pathogènes, le photopériodisme, la fertilisation, la lumière, le type de sol, la direction et la vitesse du vent, etc., font tous partie intégrante de l’environnement dont les effets peuvent-être évalués sur une population génétiquement uniforme. Rq : la variation environnementale n’est pas transmise à la génération suivante et, par conséquent, ne peut-être isolée par sélection. 2- variabilité génétique : Elle résulte du fait que des individus différents possèdent des génotypes différents. Une population constituée par des génotypes AA, Aa, aa est génétiquement variable. P1 X (AA) P2 (aa) 29

F1 : 100% Aa

F2 : ¼ AA + ½ Aa + ¼ aa

1-  toute les plantes : P1 (AA) sont homozygotes, homogènes et génétiquement identiques entres elles.  toute les plantes : P2 (aa) sont homozygotes, homogènes et génétiquement identiques entres elles.  toute les plantes : F1(Aa) sont hétérozygotes, homogènes et génétiquement identiques entres elles. 2-  la population F2 (AA, Aa, aa) est génétiquement variable, elle est constituée d’individus homozygotes et d’individus hétérozygotes et, par conséquent, hétérogène. Donc, toute la variabilité observée entre les individus de P 1, P2 ou de F1 est due à l’environnement ; et toute variabilité observée entre les individus de la population F2 est constituée d’une variabilité en partie d’origine génétique et en partie d’origine environnementale. Rq : la variabilité génétique est essentielle pour le sélectionneur. Sans elle, aucun progrès génétique n’est possible par sélection car toute la variabilité observée dans la population sera d’origine environnementale et, par conséquent, aucune fraction de cette variabilité ne peut-être fixée par sélection. 3- sources de variations : a- variations chromosomiques : (voir ultérieurement) Essentiellement due à la polyploïdie : multiple de jeux du nombre de chromosomes de base. b- Mutation : Changement d’un état héréditaire à un autre. • • Mutation génique : modification de la structure du gène et formation d’allèles nouveaux . Exp. a  A ou A  a Mutation chromosomique : changement au niveau des chromosomes. 30

La mutation peut être spontanée, ou induite par des traitements physiques (rayons X, UV, γ, etc.) ou chimiques. Ceci permet l’élargissement de la gamme de variation disponible pour le sélectionneur. 4- mesure de la variabilité : a- rappel des paramètres statistique d’une population : Les caractères quantitatifs obéissent à la loi normale, qui est définie par sa moyenne et son écart type.  La moyenne : X = Σxi/n où xi : valeur de l’individu i dans la pop n : nombre total d’individus S’il s’agit d’une distribution de fréquence : X = Σfixi/n où fi : fréquence de l’individu i dans la pop  L’écart type: S =√ Σ(xi-x)2/(n-1)  La variance : V=Σ(xi-x)2/(n-1) b- Héritabilité : h2 On a déjà vu que la variabilité dans une population peut avoir des origines génétiques et/ou environnementales. L’efficacité de la sélection pour un caractère donné dans une population hétérogène dépendra : degré de la variabilité génétique, importance des effets de l’environnement.

La sélection est inefficace si la variation environnementale est très importante et masque la variation génétique. Le degré de transmission de la variabilité d’un caractère quantitatif des ascendants aux descendants est appelé héritabilité, notée h2 ou H. Il existe plusieurs méthodes pour estimer l’héritabilité d’un caractère. Elles sont basées sur la décomposition de la variation totale en variation génétique et en variation environnementale. h2 = variance génétique / variance phénotypique 31

or : P=G+E+GXE où : P : valeur phénotypique ; G : valeur génotypique ; E : valeur environnementale ; GXE : interaction entre le génotype et l’environnement. Calcul : P=G+E V(P)=V(G+E) si G et E sont indépendants.

V(P)=V(G)+V(E) V(P) : déterminée par : V=Σ(xi-x)2/(n-1) où x= Σxi/n Xi : valeur de l’individu i dans la population N : nombre total d’individus V(E) : déterminée à partir d’une population génétiquement homogène.

Vg=Vp-Ve 

H2=Vp-Ve/Vp ou = H2=Vg/Vg+Ve

or Vg=Va+Vd+Vi où Va : variance additive ; Vd : variance de dominance ; Vi : variance due à l’interaction épistasique. On néglige Vd et Vi à notre niveau et on aura : Vg réduite à la seule valeur de Va et par suite :

h2=Va/Vp

32

Chapitre V : Variation du nombre chromosomique Définition : Le génome (X), nombre chromosomique de base, est un ensemble complet de chromosomes hérités d’un parent en tant qu’unité. Dans chaque génome, chaque chromosome est représenté une fois. 2n : indique le nombre somatique de chromosomes ; n : indique le nombre gamétique de chromosomes ; x : indique le nombre de base de chromosomes ou génome. La variation chromosomique peut toucher quelques chromosomes seulement, c’est ainsi qu’on peut avoir un ou deux chromosomes en plus ou en moins, on parle d’aneuploïdie. La variation peut toucher la totalité du génome, on parle d’euploïdie.

Exp. trois espèces d’avoine :

Espèce Avena stregosa Avena barbata Avena sativa

2n 14 28=4x 42=6x

n 7 14 21

x 7 7 7

Niveau de ploïdie diploïde tétraploïde hexaploïde

33

I- Euploïdie : Le changement dans le nombre de chromosomes implique tout le stock chromosomique. L’euploïdie comprend deux types : les autopolyploïdes et les allopolyploïdes. Organisme monoploïde diploïde n. ploïdie 2n=x 2n=2x 1- Autopolyploïdes ou Autoploïdes : Duplication des chromosomes d’une même espèce (même génome). Elle se produit spontanément chromosomique. Elle a lieu au niveau des gamètes non réduites. Caractéristiques : - cellules et noyaux volumineux ; - tiges épaisses ; - feuilles épaisses, large et de couleur verte foncée ; - grandes fleurs et grandes graines ; - racines plus développées. Mais : - réduction de la fertilité ce qui entraîne une faible production de semences, due à des désordres dans la formation des grains de pollens, de la fécondation ou le développement de l’embryon. - moins vigoureux que les parents diploïdes possédant un nombre de chromosomes de base déjà élevé. - la génétique des autoploïdes est plus complexe que celle des diploïdes. Exp. soit un locus à deux allèles : A et a Diploïdes : 3génotypes : AA ; Aa ; aa Autotétraploïdes : 5 génotypes possibles selon le nombre d’allèles dominants A : GIGANTISME ou artificiellement (colchicine) par dédoublement triploïde 2n=3x tétraploïde pentaploïde hexaploïde 2n=4x 2n=5x 2n=6x

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AAAA Quadruplexe

AAAa triplexe

AAaa duplexe

Aaaa simplexe

aaaa nulliplexe

2- Allopolyploïdes ou Alloploïdes : - Allopoïdes naturels : exp. BD, avoine, BT - Alloploïdes induits : exp. triticale. alloploïdes naturels : Exp. le blé

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AA Diploïde 2n=2x=14 Triticum monococcum

b- Alloploïdes induits : exp. triticale. Triticale : Blé X Seigle (RR) - Croisement avec Blé dur Blé dur (AABB) X Seigle RR 36

2n=4x=28 ABR (HIS)

2n= 2x=14

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2n=3x=21 DC (colchicine) AABBRR Triticale Allohexaploïde 2n=6x=42 - Croisement avec Blé tendre Blé tendre (AABBDD) 2n=6x=42 ABDR (HIS) 2n=4x=28 DC (colchicine) AABBDDRR Triticale Allooctaploïde 2n=8x=56 Caractéristiques des alloploïdes : - comme pour les autoploïdes, caractéristiques de gigantisme. Augmentation de volume pour les tiges, racines, feuilles, etc. X Seigle RR 2n= 2x=14

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- cependant, les alloploïdes n’ont pas de problèmes de stérilité ; - leur génétique est moins complexe que celle des autoploïdes, elle est généralement analogue à celle des diploïdes, avec pour chaque locus deux allèles seulement.

Alloploïdie et amélioration des plantes : - Identification d’origine génétique des esp. Polyploïdes (exp. blé) - Faciliter le transfert de gènes d’espèces apparentées - Produire des génotypes et espèces nouvelles, exp. triticale. II- Aneuploïdie : La modification du nombre de chromosomes ne touche qu’une partie du génome. Les individus aneuploïdes présentent des génomes incomplets. Il y a gain ou perte de quelques chromosomes.

Nature Nullisomiques Monosomiques Disomiques Trisomiques Tétrasomiques

Nbr Chromosomes 2n-2 2n-1 2n 2n+1 2n+2

Gain ou perte de chromosomes perte d’une paire de chromosomes Perte d’un chromosome

diploïde normale Gain d’un chromosome Gain d’une paire de chromosome

Il existe aussi : 2n-1-1

Monosomique double

Trisomique double

2n+1+1

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Chapitre VI : Méthodes de sélection A- Introduction : Plusieurs méthodes de bases sont disponibles avec différentes modifications chacune. Toutes ont leurs points forts et leurs points faibles. La méthode choisie dépendra : de la nature du caractère désiré ; de son héritabilité ; de l’importance de la variabilité présente ou disponible ; des facteurs économiques et des ressources disponibles qui sont aussi importants et influencent l’approche à suivre. I- théorie des lignées pures :

Lot hétérogène du mélange de haricot

Johanssen a examiné le poids des graines provenant de différentes plantes de haricot, il montra que la variété locale dans une culture autogame est composée d’un mélange de lignées fixées. La diversité ou la variation est entre les lignées et non à l’intérieur des lignées.

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Une fois une lignée pure établie, la sélection à l’intérieur de celle-ci est inefficace. Toute variabilité observée à l’intérieur d’une lignée pure est d’origine environnementale. Définition d’une lignée pure : C’est la descendance par autofécondation d’une plante autogame.

II- sélection dans la population hétérogène : 1- sélection massale : Les plantes sont choisies sur la base de leur phénotype supérieurs, les graines de ces sélections sont mélangées pour former la sélection massale, cette dernière est alors semée en vrac pour reconduire la génération suivante. C’est la plus ancienne méthode de sélection pratiquée par l’homme. a) caractéristiques : la sélection est basée sur le phénotype ; les caractères à sélectionner doivent se prêter à l’identification visuelle ; l’efficacité dépend de la capacité du phénotype à refléter le génotype ; efficace pour les caractères à héritabilité élevée ; peu efficace pour les caractères très influencés par l’environnement.

b) avantages : sécurité : la variation génétique à l’intérieur ou dans la sélection massale peut servir de tampon dans des conditions d’environnement changeant. Elle peut conduire à une inscription rapide de la variété. Elle ne nécessite pas de phase d’évaluation de la descendance. Simple, facile, rapide, non coûteuse.

c) inconvénient : on ne connaît pas si les plantes sélectionnées sont homozygotes ou hétérozygotes (1-5% de pollinisation croisée naturelle) puisque les plantes hétérozygotes ségrégueront les générations suivantes, donc le sélectionneur a besoin de continuer la sélection. Interaction GXE. L’environnement dans lequel la plante croit affecte son développement et son apparence. Avec la sélection massale, il n’est pas possible de connaître si le phénotype sélectionné qui est supérieur en 41

apparence est du au génotype ou à l’environnement. La sélection massale est confondue avec la sélection environnementale.

2- sélection généalogique (sélection de lignées fixées ou pure line sélection) : Elle a été développée sur les bases de la théorie des lignées pures énoncées par JOHANSSEN. La sélection de lignées fixées est utilisée pour exploiter les variétés locales où des types désirables existent. Le meilleur génotype déjà présent dans la population du mélange est isolé à travers des procédures d’évaluation bien soignées. Méthode : elle comprend généralement trois étapes : 1ère étape : Un grand nombre de sélection est fait à partir de la population d’origine 2ème étape : Des lignées de descendance sont cultivées pour observation - les mauvaises lignées sont éliminées - cette étape est répétée sur plusieurs générations 3ème étape : Les lignées restantes (les plus homogènes et les plus intéressantes pour différents caractères) sont évaluées dans des essais de rendement avec répétitions puis les meilleurs sont retenues dans des essais régionaux. La nouvelle variété (descendance d’une lignée fixée) est inscrite au catalogue officiel. Avantages : La lignée pure fixée est très uniforme en apparence et en performance. Inconvénients : de nouveaux génotypes ne sont pas crées (on est limité aux génotypes déjà présents dans la population d’origine) la lignée pure fixée peut être limitée concernant l’adaptation.

3- Comparaison entre la sélection massale et la sélection généalogique : Les deux méthodes ne vont créer des génotypes nouveaux et se limitent seulement à l’isolement de certains génotypes déjà existant dans la population d’origine. 42

Cependant une variété développée par la sélection généalogique est plus homogène qu’une variété développée par une sélection massale. La sélection généalogique est une lignée pure car elle est développée à partir d’une seule plante supposée être homozygote, alors que la sélection massale est un mélange de lignées pures. La sélection massale est relativement plus simple et moins coûteuse que la sélection généalogique. La sélection massale est souvent utilisée par les agriculteurs alors que la sélection généalogique n’est généralement utilisée que par les sélectionneurs. III- Sélection après hybridation : 1) Hybridation : - nécessaire pour combiner et sélectionner différents génotypes de ceux actuellement disponibles. - On espère obtenir des ségrégants transgressifs qui soient supérieurs aux variétés parentales. - Dans l’hybridation de deux variétés de plantes autogames, l’améliorateur des plantes est concerné par : 1- les limites et la nature de la variété dans la génération ségrégante F2 2- la progression de la population hybride vers l’homozygocie complète 3- la nature des combinaisons des gènes réussie - facteurs influancants la recombinaison des gènes à la F2 : 1- nombre de gènes différenciant les parents ; 2- liens (linkage) des gènes sur la le même chromosome ; 3- nombre d’allèles de chaque gène. - important à se rappeler : Quand deux variétés lignées fixées sont croisées, le maximum nombre de combinaison de gènes est atteinte dans la F2 (les combinaisons se produisent dans la plante F1 au moment de la fertilisation). Donc les populations F2 doivent être aussi large que les possibilités pratiques le permettent. - avec l’augmentation du nombre de générations autogames, la proportion d’homozygotes augmente. Il est plus aisé de trouver des types homozygotes désirables dans les générations avancées de la population hybride des cultures autogames. 43

2) sélection Pedigree : La méthode pedigree permet d’isoler rapidement des caractéristiques désirables dans le cas de caractères à hérédité qualitatives tels que la résistance aux maladies, la couleur de la graine, la précocité, etc. les caractères à hérédité quantitative, en particulier le rendement, sont plus difficiles à évaluer au cours des premières générations (F2 et F3) sur la base d’une plante individuelle. Du fait du haut niveau d’hétérozygotie durant les premières génération, l’hétérosis peut affecter la performance des plantes surtout lorsqu’elles sont espacées. Cependant, les sélectionneurs tendant à choisir les plantes qui apparaissent les plus productives.

Sélection “Pedigree”
Parents Var (A) X Var (B) Choisir les parents et faire les croisements Semer 50 – 100 graines F1 F1 Bulk Semer 2-3000 plantes F2 : plantes espacées  examen facile de plantes individuelles. Récolter séparément les plantes (2-300) qui combinent les caractéristiques désirables des deux parents. Semer les plantes F2 Epi/ligne, plantes espacées. Identifier les lignes > et sélectionner 3-5 plantes/ligne  20-100 familles (F3) retenues/croisement. Identité de la plante et de la ligne conservée.

F2 Plantes espacées

F3 épi/ligne

F4 Familles Epi/ligne F5 //

Semer plantes/ligne. Choix des meilleures plantes dans les meilleures lignes et dans les meilleures familles. Seules les meilleures apparences et les lignées uniformes sont conduites.

F6 //

Lignes uniformes sont récoltées en masse, mais, séparément des autres lignes. (25-30) par croisement.

F7 // Essai préliminaire. F8 Essais de performance EP EI EA Essai catalogue

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F9 – F12

3) Sélection Bulk : La méthode Bulk est simple et peu coûteuse. Peu d’efforts sont généralement engagés durant les premières générations. Cependant, la taille de la population doit être assez importante surtout lorsque les plantes sont individualisées durant la sélection. La sélection naturelle est plus active dans le cas de la sélection par cette méthode. Les plantes hautes et les plantes tardives sont généralement favorisées par la méthode Bulk, ce qui peut être en contradiction avec les aspirations du sélectionneur. Cependant, la présence de maladies et d’insectes favorisent la mise en évidence des plantes résistantes, généralement recherchées par le sélectionneur.

Sélection “BULK”
Parents Var (A) X Var (B)

F1 Bulk

Choisir les parents et faire les croisements Semer 50 – 100 graines F1

F2 //

F3 //

Semer en « Bulk » toutes les F2 récoltées (plantes non espacées). Densité normale de semis. Récolter le tout en vrac et prendre un échantillon pour le semer en F3. (0,005 à 0,01 ha par croisement).

F4 // F5 //

Même procédure que la F2

F6 plantes espacées

Semer 5000 – 10000 plantes espacées. choisir 500-1000 meilleures plantes. Récolter chaque plante sélectionnée séparément.

Semer les plantes choisies en F6, plante/ligne. Choisir les 50 à 100 meilleures lignes (lignées). Récolter séparément. F7 plante/ligne Essai préliminaire.

F8

Essais de performance EP EI EA Essai catalogue

45

F9 – F12

4) Sélection SSD (single-seed-descent) : Dans la procédure décrite ici, chaque plante F2 contribue par une seule graine à la génération F3, chaque plante F3 contribue par une seule graine à la génération F4 et ainsi de suite. Le but est d’obtenir des lignées à partir d’un maximum de plantes F2. Ceci permet de réduire les risques de pertes de génotypes supérieurs par sélection (artificielle ou naturelle) surtout pour les caractères à faible héritabilité tel que le rendement. Cependant, cette procédure oblige à conserver une grande proportion de génotypes non désirables et ne permet pas la sélection des meilleurs génotypes parmi les familles issues des F2 et des générations suivantes. La méthode est simple et peu coûteuse. Il suffit seulement de récolter une graine par plante et de semer l’ensemble à la génération suivante. La sélection par la méthode SSD est plus pratique lorsqu’on peut obtenir plus d’une génération par an. L’utilisation des serres et pépinières en contre saison permettent d’avancer rapidement des générations.

Sélection “S S D”
Parents F1 Bulk F2 plantes espacées Var (A) X Var (B) Choisir les parents et faire les croisements Semer 50 – 100 graines F1 en les espaçants pour permettre la production du maximum de semences. Semer les F2 récoltées (2000-3000 plantes) en les espaçants. Récolter une graine/plante F2.

F3 //

Même procédure que la F2

F4 // Même procédure que la F2. Récolter chaque plante F5 séparément Semer les F5, plante/ligne. Le nombre de plantes F2 correspond au nombre de plantes F6 (lignées). Chaque ligne sera issue d’une plante F2. Choisir et récolter les meilleures lignes. Essai préliminaire. F7

F5 //

F6 plantes/ligne

F8 – F12

Essais de performance EP EI EA Essai catalogue

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5) comparaison des trois méthodes de sélection : Pour la méthode Pedigree, la sélection commence en F2. La première sélection est faite parmi les plantes hétérozygotes. Pour la méthode Bulk, la première sélection est faite plus tard sur la base de plantes homozygotes. Par contre, pour la méthode SSD, la sélection est faite sur la base de lignées homozygotes (descendance de plantes homozygotes par autofécondation). La méthode Pedigree est plus coûteuse et plus laborieuse que les deux autres méthodes mais elle permet l’élimination rapide des génotypes inférieurs (certains génotypes supérieurs peuvent être accidentellement éliminés aussi) par la sélection durant les premières générations. La sélection naturelle est plus active dans le cas de la sélection par la méthode Bulk et peut aider le sélectionneur comme elle peut lui poser des problèmes. La sélection par la méthode SSD permet de garder la descendance d’un nombre maximum de plantes F2. Le goulot d’étranglement pour la méthode SSD est, cependant, le nombre élevé de lignées à tester pour le rendement. Le choix de la méthode de sélection dépend de la plante en question, de la philosophie du sélectionneur, des objectifs du programme de sélection et des moyens disponibles (terrain, équipements, personnel, etc.).

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6) Backcross : Le Backcross, également appelé rétro-croisement ou croisement en retour, est une forme d’hybridation récurrente durant laquelle une caractéristique désirable est transférée à une variété adapté et productive. Généralement, le Backcross est utilisé lorsqu’une variété possédant des caractéristiques désirables présente une faiblesse (sensibilité à une maladie donnée par exemple) qui peut être corrigée par l’introduction d’un ou de quelques gènes. La procédure consiste à croiser la variété adaptée dont on veut modifier une caractéristique donnée avec une variété qui possède cette caractéristique et de faire le Backcross de la descendance sur la variété adaptée. La descendance de ce Backcross subit un autre backcross sur la variété adaptée et ainsi de suite. Dans le Backcross, la variété adaptée (qui entre toujours dans le croisement) est appelée parent récurrent ou parent receveur et la variété source (qui n’entre dans le croisement qu’une seule fois) est appelée parent non récurrent ou parent donneur. L’objectif du backcross est de restituer au parent récurrent tous ses gènes, sauf le ou les gènes qui contrôle (nt) la caractéristique à transférer. Le Backcross est plus facile si le caractère à transférer est : - dominant - hautement héritable - facilement reconnaissable dans la descendance hybride. Il est plus difficile si le gène en question est fortement lié à d’autres gènes non désirables et si le caractère à transférer est contrôlé par plusieurs gènes. Il n’est pas nécessaire de tester la variété développée par la méthode du Backcross pour le rendement. En principe, la performance des variétés développées par cette méthode est au moins égale à celle de la variété utilisée comme parent récurrent.

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Sélection Backcross
Var. résistante (B) Var. adaptée et sensible (A)

”D”
X

”R”
Croisement initial d’introduction

RR
50% des gènes de A

rr
X

”R” B.C.1 rr
X

Rr

”R”

75% des gènes de A

B.C.2 rr
X

rr (éliminé )
87.5% des gènes de A

Rr

”R”

rr (éliminé )
93.75% des gènes de A

Rr

rr
X

”R”

B.C.3

rr (éliminé )
96.875% des gènes de A

Rr

rr
X

”R”

B.C.4

rr (éliminé )
98.3775% des gènes de A

Rr

rr (éliminé ) Rr rr

B.C.5

Résultat du B.C.5 Autofécondation

”D” : Variété donneuse ”R” : Variété récurrente

¼ RR

½ Rr

¼ rr

R (AA)

éliminé par Progeny test

éliminé par inoculation

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PARTIE II CULTURE IN VITRO DES PLANTES

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Les biotechnologies végétales
Définition Les biotechnologies végétales comprennent toutes les méthodes et techniques utilisant les capacités génétiques et physiologiques du vivant pour mieux conduire ou contrôler des processus naturels, ou mieux produire et purifier des substances issues de la transformation biologique de substrats naturels LA MULTIPLICATION VÉGÉTATIVE Avantages et inconvénients de la multiplication végétative par rapport à la voie sexuée (graines) : - Avantages : obtention de plantes présentant toutes les mêmes caractéristiques : clones. - Inconvénients : beaucoup d’espèces sont réfractaires à la multiplication végétative. LA CULTURE IN VITRO Tous les végétaux ne peuvent donc pas être multipliés par voie végétative. Pourquoi de nombreuses espèces sont-elles réfractaires aux techniques traditionnelles de multiplication végétative ? Si on arrive à bouturer des tiges, pourquoi n’arrive-t-on pas à faire la même chose avec les racines ? Pourquoi n’arrive-t-on pas à bouturer des petits morceaux de plantes ? C’est pourquoi, devant ces problèmes, les chercheurs se sont tournés vers une autre technique : LA CULTURE IN VITRO. LES GRANDES ÉTAPES DE L’AVÈNEMENT DE LA CULTURE IN VITRO  1870 : Premières tentatives de culture d’organes vivants isolés : conservation de queues de têtards de grenouille. LA TOTIPOTENCE CELLULAIRE Dès 1902, Haberland, un biologiste allemand, observe les potentialités naturelles de la multiplication Végétative (bouturage). Suite à ces travaux, il énonce le premier grand principe qui ouvrira la voie de la micropropagation des végétaux. Il s’agit du principe de la totipotence cellulaire.

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Définition "Toute cellule végétale est capable de régénérer un autre individu identique à celui dont elle est issue". La dédifférenciation cellulaire La dédifférenciation cellulaire : on voit les grandes cellules différenciées (dans les feuilles, tiges, pétales,...) perdre leurs vacuoles, leur noyau se diviser activement, et de nombreuses et très petites cellules méristèmatiques apparaître. Une cellule dédifférenciée peut alors évoluer dans toutes sortes de directions. PREMIERS SUCCÈS ! En 1934, WHITE réussit la culture de racines de tomate sur un milieu contenant de l' eau, des sels minéraux ,un extrait de levure et du sucre et une hormone végétale, la seule connue à l’époque : l’auxine*. Mise en évidence du cal En 1939, Gautheret obtient à partir de tissu carotte, un amas de cellules dédifférenciées : un cal. On peut cultiver ce cal indéfiniment dans le temps. Avec lui démarre vraiment la culture in vitro ("dans du verre"). UN MILIEU MIRACLE En 1962, Murashige et Skoog étudient la multiplication végétative du tabac et mettent au point le premier milieu de base pour la culture in vitro. Ce milieu contient des sels minéraux, des sucres, des vitamines B, des auxines et des cytokinines. Ce milieu rend possible la culture et la prolifération de méristèmes de tiges jusqu’alors réfractaires à la multiplication végétative in vitro. FONDEMENTS TECHNIQUES de la CULTURE IN VITRO : La technique in vitro est un mode de multiplication végétative artificielle des plantes. Il s’agit d’un ensemble de méthodes faisant intervenir d'une part l'asepsie (stérilisation du matériel, désinfection des explants). Et d'autre part des conditions de culture parfaitement contrôlées (milieux de culture définis pour chaque type de plante, température, lumière, humidité,...).

Les explants : 52

Ces méthodes s'appliquent à des organes ou des fragments d’organes : les explants. • • • • • • • • • • graine immature, embryon, ovule, pollen, bourgeon terminal, bourgeon axillaire, morceau de tige, morceau de feuille, de pétale de fleur, etc.

Exigences de l’explant : L'explant doit trouver dans le milieu de culture tout ce dont il a besoin pour survivre, se multiplier et éventuellement régénérer un nouvel individu, en fait, tout ce que la plante mère peut fournir : a) par les racines : les éléments minéraux, l’eau ; b) par les feuilles et grâce à la photosynthèse : des sucres, des vitamines et des acides aminés ; c) les hormones, pour orienter la formation des organes. LE MILIEU DE CULTURE : Entreront dans la composition du milieu de culture: - des éléments minéraux ; - des éléments organiques ; - des régulateurs de croissance (hormones). A) LES ÉLÉMENTS MINÉRAUX 1- Les macroéléments : interviennent en grande quantité. Il s'agit de 6 éléments présents à des concentrations élevées tels que l’azote ( N), le calcium (Ca), le potassium (K), le soufre (S), le magnésium (Mg) et le phosphore (P).

2- Les microéléments : 53

Appelés parfois oligo-éléments, et bien qu'ils ne soient nécessaires à la plante qu'en faibles concentrations, leur rôle est essentiel. Les principaux d'entre eux sont le fer (Fe), le cuivre (Cu), le zinc (Zn), le manganèse (Mn), le molybdène (Mo), le bore (B) et le chlore (Cl), le cobalt (Co), le nickel (Ni), etc. B) LES ÉLÉMENTS ORGANIQUES : 1- Les sucres : 2- Les vitamines : 3- Les acides aminés : 1- Les sucres : Dans le cas de tissus végétaux placés en culture in vitro, l'assimilation chlorophyllienne est nulle ou insuffisante pour assurer la survie et le développement de l'explant. Dès lors, on ajoute des sucres, le plus souvent du saccharose, aux milieux de culture pour fournir à l'explant une source de carbone. Dans la nature, les sucres sont photosynthétisés à partir du gaz carbonique atmosphérique et de l'eau du sol. 2- Les vitamines : L'emploi de diverses vitamines favorise fréquemment le développement des cultures in vitro: elles appartiennent essentiellement au groupe B. 3- Les acides aminés : Il a parfois été observé que l'apport d'acides aminés favorisait la prolifération. Touche finale : Les milieux ainsi constitués sont liquides. Il est nécessaire de les solidifier par l’ajout d’un gélifiant pour éviter que les explants ne tombent au fond des récipients et s’asphyxient.

C) LES RÉGULATEURS DE CROISSANCE : 54

Appelés généralement hormones végétales, ils induisent les phénomènes de croissance et de néoformation des organes. On trouve ces substances de croissance naturellement dans toutes les plantes; cependant, on a pu synthétiser artificiellement des molécules possédant les mêmes propriétés. Les hormones utilisées sont principalement : - les auxines, - les cytokinines, Car ces hormones sont capables d’orienter les explants vers la formation de nouveaux organes.

Multiples Applications de la Culture in vitro des Végétaux Supérieurs. 55

♦ La culture de méristème et la production de plantes saines. ♦ La micropropagation. ♦ L‘embryogenèse somatique. ♦ La variation somaclonale et la sélection in vitro. ♦ La culture de protoplastes et l'hybridation somatique

CHAPITRE I : LA CULTURE DES MERISTEMES

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1.1 Introduction Les méristèmes sont constitués de massifs de cellules non différenciées, qui conservent la capacité de se diviser activement. Les zones méristématiques jouent un rôle capital dans le développement du végétal, puisqu’elles édifient tous les organes (végétatifs et reproducteurs) ainsi que les tissus de la plante. La culture des méristèmes présente des implications importantes dans : Les procédés de multiplication végétative (micropropagation), L’éradication de nombreuses maladies (viroses, mycoses, mycoplasmoses et bactérioses), Les processus permettant le retour à l’état juvénile et dans la conservation des souches. 1.2 Définitions 1.2.1 DIFFERENTS TYPES DE MERISTEMES Chez les végétaux supérieurs, il existe plusieurs catégories de tissus méristématiques, qui diffèrent par leur localisation, leur structure et leur rôle dans la plante. • • • • Les méristèmes primaires Les méristèmes secondaires Les méristèmes floraux Les méristèmes primaires

Ils apparaissent en premier au cours de l'embryogenèse. Ils sont situés aux extrémités des tiges (m. caulinaires) et des racines (m. racinaires) dont ils assurent la croissance en longueur de la plante et donnent naissance aux tissus primaires et aux méristèmes secondaires ; ils sont organogènes.

MÉRISTÈME APICAL Les méristèmes secondaires : 57

Ils sont à l’origine de la croissance en épaisseur des tiges et des racines, principalement des (gymnospermes et des angiospermes). Ils sont à l'origine des tissus dits secondaires. Les méristèmes floraux : Ils résultent de la transformation des méristèmes caulinaires en méristèmes floraux. Leur fonctionnement est limité à l’élaboration de certaines pièces florales (étamines et carpelles en particulier). AVANTAGES DE LA CULTURE DES MÉRISTÈMES La culture des méristèmes présente des implications importantes dans : les procédés de multiplication végétative (micropropagation), l’éradication de nombreuses maladies (viroses, mycoses, mycoplasmoses et bactérioses), thermothérapie, les processus permettant le retour à l’état juvénile et dans la conservation des souches. CONCLUSION La culture de méristèmes offre des possibilités considérables. Elle permet : La reproduction intensive d’individus hautements sélectionnés avec un taux de multiplication plus élevé que par les méthodes de cultures traditionnelles et le maintient de la conformité variétale du matériel; La régénération des souches atteintes par de nombreuses maladies infectieuses; La conservation à long terme (cryoconservation) des génotypes intéressants (plantes en voie de disparition, variétés anciennes) dans un but de sélection de cultivars encore plus performants.

CHAPITRE II : LA MICROPROPAGATION 2.1 Introduction 58

Le taux de multiplication par culture de méristèmes reste comparable à celui du bouturage classique tant qu’à partir d’un apex on induit le développement d’une seule plante. Cependant il est possible de provoquer la prolifération de bourgeons axillaires dans la zone proche du méristème notamment par adjonction de cytokinines dans le milieu de culture. Ensuite par repiquage successif on amplifie le phénomène et on peut ainsi obtenir des taux de multiplications très supérieurs à ceux des méthodes classiques allant de 104 à 108 par an. 2.2 Définition Les plantes se reproduisent par la voie sexuée via les graines, mais elles utilisent pour certaines aussi une autre voie, celle de la multiplication végétative. Le clonage végétal est exploité depuis des siècles par les horticulteurs et jardiniers : bouturage, marcottage, greffage etc. La micropropagation in vitro dérive de ce phénomène naturel.. Pratiquement, n’importe quel organe (bourgeon, racine, feuille, anthère, etc.) ou fragment d’organe (explant), prélevé sur une plante, peut être cultivé isolément sur milieu nutritif synthétique. Organes, tissus ou cellules → proliférer anarchiquement → cals  dvpt bourgeons et/ou racines → plantules viables Suite aux subcultures successives on obtient alors des plantes identiques à la plante de départ et que l'on peut multiplier à l'infini. 2.3 Objectif Il s'agit de produire en grande quantité des cultivars d'intérêt horticole, sylvicole, ou agronomique qui viennent d'être créés ou découverts. Il peut s'agir également de plantes difficiles à reproduire naturellement.

2.4 Classification sommaire des techniques de multiplication végétative artificielle chez les Angiospermes 2.5 Les types de multiplication végétative in vitro 59

2.5.1 Multiplication par bourgeonnement axillaire En provoquant et en accélérant le débourrement axillaires normale des explants présents naturellement à la base des feuilles (chaque rameau latéral constitue potentiellement une nouvelle plantule). Le même développement peut être provoqué à partir de tiges ou d'inflorescences pour autant qu'ils comportent des noeuds, et par conséquent des bourgeons axillaires. Cette technique ne fait donc qu'accélérer in vitro le fonctionnement normal des méristèmes de bourgeons déjà formés sur une plante. 2.5.1.1 Technique A- L’explant initial: méristème isolé, bourgeon terminal ou axillaire, extrémité de tige, fragment de tige comportant au moins un B.axillaire B- sur un milieu approprié comportant peu de cytokinines, le méristème croit ou le bourgeon débourre, et se développe en une tige feuillée. C- cette tige peut être découpée en fragment (nœud et extrémité de tige) qui, remis sur le même milieu, vont redonner autant de tiges feuillées. D- Si l’explant initial est déposé sur un milieu plus riche en cytokinines, le bourgeon débourre et donne une tige feuillée qui se ramifie elle même et donne des rameaux secondaires. E- les touffes de bourgeons sont fragmentées et la multiplication se réalise à ce stade. F- lorsque le bourgeon axillaire est intense, une phase d’élongation (acide gibbérellique), qui permet de le freiner, est nécessaire avant l’enracinement. G- Les tiges peuvent alors être transférées sur un milieu neutre ou enrichi en auxines, qui permet leur enracinement. Les plantules complètes sont alors acclimatées en terre où elles reconstituent des plantes normales

2.5.1.2 EXEMPLE : LE SÉQUOIA (Sequoiadendron giganteum) 60

A. L'explant initial peut être soit un méristème, soit un bourgeon, soit un fragment de tige comportant au moins un bourgeon axillaire. B. Sur un milieu approprié comprenant des cytokinines, le méristème se divise ou le bourgeon débourre et développent tous les deux une tige ou une touffe feuillée. C. Cette tige peut être découpée en fragments (noeuds) qui, remis sur le milieu, vont redonner autant de touffes feuillées qui peuvent être aussi subdivisées : c’est la phase de multiplication. D. Les tiges peuvent alors être transférées sur un milieu enrichi en auxines, qui permet leur enracinement. On obtient finalement dans chaque tube une plantule complète. E. Les plantules sont mises en acclimatation en terre où elles reconstituent des plantes normales. Le nombre de plants de Séquoia obtenus en 1 an à partir d’un méristème peut atteindre par cette méthode (46). Cela représente une plantation de 16 hectares d’arbres adultes ! 2.5.2 Multiplication par bourgeonnement adventif En provoquant l'apparition de bourgeons adventifs en des endroits inhabituels (chaque bourgeon est une plantule potentielle). L'initiation de tels bourgeons peut être en principe induite sur n'importe quel type d'organe ou de tissu (feuille, tige, racine...). 2.5.2.1 Technique A- L’explant est constitué d’un fragment d’organe, d’une portion de tissu(s), ou même de cellules isolées (grains de pollen, protoplastes). B- les bourgeons sont néoformés directement à partir des cellules de l’explant initial. C- ces bourgeons se développent en tiges, généralement sur le même milieu sinon, sur un milieu d’allongement. D- Les cellules de l’explant initial se divisent rapidement et forment, de manière désorganisée, un cal primaire rattaché à l’explant de départ. E- Le cal primaire peut être subcultivé sur un milieu solide d’accroissement du cal. F- Le cal forme des bourgeons sur un milieu d’induction approprié. Toutes les tiges obtenues sont transférées sur un milieu neutre ou enrichi en auxine qui va provoquer leur enracinement. EXEMPLE : LE SAINTPAULIA (Saintpaulia ionantha Wendl.) 61

A. L'explant est constitué d'un fragment d'organe, d'une portion de tissu, ou même de cellules isolées. B. Il est placé sur un milieu contenant des cytokinines. Soit des bourgeons sont néoformés directement à partir des cellules de l'explant initial (rare). C. Soit des cellules de l'explant initial se divisent rapidement et forment un cal primaire rattaché à l'explant de départ et qui donnera des bourgeons néoformés. C’est la phase de multiplication. D. Toutes les tiges obtenues dans les deux cas sont transférées sur un milieu enrichi en auxine qui va provoquer leur enracinement. E. Les plantules sont alors acclimatées en terre où elles reconstituent des plantes normales.

CHAPITRE III : L’EMBRYOGENÈSE SOMATIQUE (Semences
artificielles)

3.1 Introduction Dans une graine, on trouve la future plante sous forme d’embryon (embryon zygotique) qui résulte de la reproduction sexuée. Il s'agit en fait d'une structure

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bipolaire qui, suite au processus de germination, donne naissance à une nouvelle plante. Habituellement, l'embryon s'édifie à partir d'une cellule initiale, le zygote, formé lors de la reproduction sexuée (embryon zygotique). Cependant, des embryons peuvent également être induits en culture in vitro sur un milieu approprié (embryon somatique). De tels embryons se développent directement à partir de cellules méristématiques ou plus souvent sur des cultures de cals. 3.2 Définition L'embryogenèse somatique consiste à provoquer l’apparition d’embryons à partir de tissus végétaux mis en culture in vitro. Elle apparaît le plus souvent dans les suspensions cellulaires, occasionnellement dans les cals, plus rarement directement sur les organes. 3.2.1 Technique A- l’explant de départ est, comme dans le cas précédant, un fragment d’organe, de tissu(s), ou constitué de cellules isolées. B- Un cal primaire (à partir d’un organe) ou des microcales (à partir des cellules isolées) sont formés. C- Subculture du cal primaire ou des microcals D- Le cal peut être dissocié et être multiplié sous forme de suspension cellulaire. La suspension cellulaire remise sur un milieu solide peut redonner du cal. E- Sous certaines conditions, les cultures cellulaires en milieu solide ou liquide s’organisent en nombreux petits massifs à structure bipolaire (avec un méristème caulinaire et méristème racinaire) nommés embroïdes, embryons asexués ou embryons somatiques. F- Les embryons se développent, comme des embryons zymotiques, directement en plantules enracinées comme des plantules de semis traditionnel. G- Des recherches actuelles tentent l’encapsulation des embryons somatiques, sans altérer leur viabilité, pour en faire des semences artificielles.

3.2.2 EXEMPLE : LE GINSENG A. Sous certaines conditions, les cultures cellulaires s'organisent en nombreux petits massifs à structure bipolaire (avec un méristème de tige et un méristème de racine) nommés embryons somatiques. B. Comme les embryons zygotiques (qui sont présents dans les graines), les embryons somatiques se développent, directement en plantules enracinées. 63

C. Des recherches actuelles tentent l'encapsulation des Embryons somatiques, sans altérer leur viabilité, pour en faire des semences artificielles. 3.2.3 Avantages de l'embryogenèse somatique par rapport à la

micropropagation conventionnelle Les embryons somatiques peuvent être induits à partir de cellules cultivées en suspension, ce qui rend possible une production en fermenteur et réduit considérablement le coût de production. Les taux de multiplication sont généralement importants et chez certaines espèces, les embryons peuvent être encapsulés et traités comme des graines artificielles. Des plantes complètes sont obtenues directement suite au processus de germination. Les manipulations sont donc simplifiées par rapport à la micropropagation traditionnelle qui nécessite plusieurs milieux différents pour le développement des tiges et des racines et l'obtention de plantules complètes. 3.2.4 Difficultés subsistantes en embryogenèse somatique : L'induction du potentiel embryogène et la régénération restent souvent difficiles. Les cultures de cals, et plus encore les cultures de cellules isolées, sont propices à l'apparition de mutations géniques pouvant être responsable d'une variabilité des plantes issues de la culture. Toutefois, dès que cette variabilité sera maîtrisée, l'embryogenèse somatique permettra de produire des quantités très élevées de plantes à faible coût. Certaines espèces, telles que le palmier dattier ou certains conifères font déjà l'objet d'une production industrielle par embryogenèse somatique. 3.2.4 Applications : le sauvetage d'embryons immatures Pour améliorer les variétés cultivées (résistance aux maladies), on effectue l'hybridation interspécifique. Or parmi les causes d'échecs de cette technique figure la faiblesse des embryons notamment lors du croisement d'espèces phylogénétiquement distantes. La culture d'embryons immatures a permis d'obtenir des plantes hybrides interspécifiques comme la courgette : Cucurbita pepo x, la laitue : Lactuca sativa x, le haricot : Phaseolus vulgaris ... EXPERIENCE : LE MICROBOUTURAGE DU SAINTPAULIA Cette plante que l'on trouve chez tous les fleuristes se prête bien à cette expérience par la simplicité de ses exigences et sa résistance. Nul besoin de régulateurs de 64

croissance ou d'un milieu complexe pour réaliser le microbouturage, l'eau du robinet suffira. Matériel nécessaire Un Saintpaulia, une lame de rasoir, un flacon à goulot étroit, de l'eau du robinet, de la patience... Comment procéder ? Sectionner une feuille à la base de son pétiole avec la lame de rasoir, perpendiculairement à son grand axe. Passer le pétiole sous l'eau du robinet pour enlever d'éventuels fragments de terre. Remplir d'eau du robinet le flacon et placer le pétiole dedans. Mettre le tout devant une fenêtre. Changer l'eau une ou deux fois par semaine. Ne pas hésiter à nettoyer le flacon si des algues s'y développent. Si vous partez en vacances, vous pourrez laisser la même eau pendant un mois à condition que l'ouverture du flacon soit suffisamment étroite pour limiter l'évaporation. Au bout d'un mois environ, des racines apparaissent au niveau de la section. Environ un mois après, ce sont une demi-douzaine de microfeuilles qui font leur apparition entre les racines et le pétiole sectionné.

CHAPITRE IV : LES TECHNIQUES IN VITRO CHEZ LA POMME DE TERRE Introduction La pomme de terre appartient à la famille des Solanacées comme le tabac, le piment et l’aubergine. La partie comestible est le tubercule qui est une tige souterraine dans laquelle se sont accumulées des réserves. Le tubercule est aussi l’organe de 65

propagation. En effet, la pomme de terre est une espèce à reproduction végétative préférentielle. Cette particularité a orienté les méthodes de sélection et de production de plants vers des techniques de clonages de plus en plus performantes. Dans ce contexte, les techniques in vitro ont une place prépondérante.

Les techniques in vitro chez la pomme de terre La pomme de terre est sans doute l’espèce végétale qui a le plus bénéficié des techniques in vitro pour son amélioration génétique et sa production de plants. C’est aussi une des espèces qui se prête le mieux aux travaux d’isolements et de fusions de protoplastes ainsi que de transfert de gènes ce qui lui promet un bel avenir même si le consommateur la boude de plus en plus. Culture in vitro de la pomme de terre La mise en culture peut être effectuée à partir de germes issus de tubercules ou de méristèmes prélevés sur une plante. Le milieu de Murashige et Skoog (1962) convient tout à fait au microbouturage et à la microtubérisation. Par ailleurs, il est intéressant d’étudier l’influence des hormones sur la croissance des organes végétatifs. Citons comme exemple la GA3 à la concentration de 0.1 mg/l qui a un effet très significatif sur le nombre de nœuds produits et sur leur taille. Milieu de culture : Milieu de Murashige & Skoog (M.S) Protocole expérimental : Préparation : tous les plants de travail doivent être passés à l’hypochlorite de calcium à 2 % pendant 10mn puis rincés à l’eau avant la manipulation. Celle-ci devra se faire dans les meilleures conditions de stérilité possibles, i.e. autour de la flamme d'un bec Bunsen. Le plant de travail préparé et organisé, le plant de PDT est enlevé de son pot et posé à plat sur une feuille de papier stérile, à l'aide de la pince préalablement désinfectée. A l'aide d'un scalpel ou d'une lame de rasoir, on coupe des fragments de tiges ( mais aussi de feuilles, de racines, de pétioles, pour effectuer des comparaisons) à partir du plant. Pour les fragments de tiges, qui donneront les meilleurs résultats, les fragments doivent avoir 5 mm à 1 cm de longueur et inclure un bourgeon. Tous les fragments préparés sont rassemblés dans une (ou des) boîte(s) de Pétri stérile(s). 66

Mise en culture : On devra donc implanter dans un milieu nutritif l'un des fragments préparés précédemment. Pour ceci, à l'aide de pinces stériles, on prend délicatement le fragment et le dépose dans le sens de la plante en l'enfonçant légèrement dans le milieu de culture. Pour un fragment avec bourgeon par exemple, on enfonce l'explant dans le milieu jusqu'au bourgeon. Cette brève manipulation doit être effectuée avec calme et attention, et dans les conditions d'asepsie les plus poussées possibles. En effet les milieux de bouturages in vitro se prêtent aussi remarquablement à la croissance de divers champignons et bactéries. La présence de ces hôtes inhibe fortement la prise de la bouture. Conditions de culture : Les tubes refermés seront placés à une température de 22°C et à la lumière. Une armoire de culture in vitro est tout à fait satisfaisante, mais un simple aquarium avec une rampe horticole suffit pour obtenir de bon résultat. Pensez à respecter un photopériodisme de 16h/24h. Résultat : Dans un premier temps, l'explant peut légèrement brunir, puis au bout de une à deux semaines, le bourgeon se développe juste avant ou en même temps que les premières racines. Un cal peut éventuellement se développer à partir du bourgeon et en donner d'autres. Notons que selon l’espèce employée, la succession des phénomènes peut être différente et être plus ou moins rapide.

Assainissement des variétés La production de plants de pomme de terre débute par le choix de quelques tubercules sains qui après une dizaine de cycles de multiplication donneront plusieurs tonnes de plants certifiés (plants de classe A) commercialisés aux agriculteurs et jardiniers. Avant la mise au point de techniques de clonage in vitro la production de plants s’avérait difficile et très laborieuse. En effet, la pomme de terre est très sensible à de nombreux virus et bactéries qui sont transmis à chaque génération par le tubercule et pour lesquels aucune lutte chimique n’est possible. A chaque cycle de multiplication aux champs, les plantes accumulent donc ces 67

parasites qui entraînent des dégénérescences et donc des chutes de rendements parfois considérables. En 1954, la culture de méristèmes fut utilisée sur la pomme de terre par G. Morel et Cl. Martin de l’INRA de Versailles. Les méristèmes mis en culture au cours de cette expérience provenaient de tubercules maintenus à l’obscurité sous une forte température (37°C - 38°C). Production de masse de plants sains Ces mêmes chercheurs eurent l’idée de réaliser les premières étapes de la production de plants par la voie in vitro pour limiter les étapes de pleins champs où les plantes peuvent à nouveau être contaminées. Ceci fut d’autant plus facile que la pomme de terre se multiplie facilement et rapidement par microbouturage. En effet, à partir d’un apex, il est possible de produire plusieurs millions de plants par an. A partir des travaux de Morel et Martin, l’équipe du professeur Nozeran (université d’Orsay) a mis au point un protocole de production basée sur une multiplication in vitro des premières générations de plants, à partir d’un tubercule sain sur lequel un ou plusieurs apex seront prélevés (figure 1).

La technique A- On s’assure que le ou les tubercules de départ sont sains (F0). Des observations visuelles sont insuffisantes et les tests immuno-enzymatique de type "ELISA" permettent de repérer de façon sensible la présence de virus et de bactéries dans le tubercule de départ. B- Les tubercules sains sont mis à germer en condition de température élevée (37°C-38°C), les apex sont alors prélevés et cultivés in vitro. C- Après quelques semaines, l’apex a régénéré une plante entière qui porte de 5 à 10 noeuds. Chaque noeud repiqué sur un milieu adéquat donnera en 3-4 semaines une plantule de 5 à 68

10 noeuds. Avec un coefficient de multiplication de 7 environ par mois, un apex peut donc générer 712 plantes en un an. D- Les vitroplants sont ensuite repiqués en terreau et acclimatés en serre "insect-proof". Les établissements producteurs de plants ont intégré la culture in vitro de manière à limiter le nombre de cycles de multiplication en pleine terre et aux champs et donc de réduire les contaminations virales en tenant compte des limites de la multiplication en laboratoire. Ainsi, la sélection par "familles", qui nécessitait dix années de multiplication aux champs pour produire des plants certifiés (figure 2), a laissé progressivement la place au schéma de sélection par boutures (figure 3) qui nécessite 5 à 7 ans de multiplication avec une première année de multiplication in vitro (génération BO) et une deuxième année de culture en terreau et en serre insect-proof (génération B1). Avantages par rapport au schéma "famille" : Le nombre réduit de multiplications en pleine terre confère un meilleur état sanitaire du plant, En produisant dans un délai plus court le plant certifié, les producteurs s’adaptent plus aux exigences du marché, La multiplication permet une meilleure gestion des nouvelles variétés. La culture in vitro de la pomme de terre offre de plus un avantage indéniable pour la conservation de plants sains. En effet, une fois introduite en milieu stérile une nouvelle variété est à l’abri de toute contamination virale et peut être conservée indéfiniment. Les microtubercules, avantages et inconvénients Les microtubercules sont des tubercules de petites tailles (4 à 8 mm de diamètre) produits in vitro à partir de vitroboutures. Il ne faut pas les confondre avec les minitubercules qui sont obtenus par tubérisation en serre des vitroplants (10 à 25 mm de diamètre) et qui représentent la génération B1 plantée en pleine terre et au champ (figure 3). La technique de microtubérisation a été introduite par le CIP (Centre International de la Pomme de Terre) situé au Pérou et qui rassemble la plus grande collection de pommes de terre sauvages au monde. Ces tubercules représentent un intérêt certain pour la conservation des cultivars, leur stockage ainsi que pour les échanges internationaux. 69

Les microtubercules, avantages et inconvénients Rapidement, cette technique de microtubérisation a intéressé les producteurs de plants. En effet, le microtubercule peut être stocké en chambre froide pendant plusieurs mois, ce qui permet d’étaler la production au laboratoire. De plus, il est moins fragile que la bouture et donc plus souple d’emploi pour le producteur de plants. Cependant, son coût de production reste actuellement supérieur à celui de la bouture et son cycle de production beaucoup plus long. Cette technique est donc moins souple vis à vis des contraintes du marché ; la production de plants doit être planifiée un an à l’avance alors que la production de boutures est réalisable en quelques mois. Le microtubercule reste cependant une technique complémentaire de la microbouture et est utilisé par la plupart des producteurs de plants (figure 4).

CHAPITRE V : VARIATIONS SOMACLONALES Introduction Alors que la micropropagation produit généralement des plantes d'une grande conformité génétique, un taux élevé de variation peut être induit en culture in vitro lorsque les cultures sont réalisées dans des conditions particulières. Plus précisément, les plantes régénérées à partir de cultures initiées d'explants différenciés (ne contenant pas de méristèmes préexistant) ou à partir de cultures de cals présentent des taux parfois importants de non-conformité. Cette variabilité semble de plus être proportionnelle au temps de culture. 70

Des mutations induites pendant la culture ont été détectées chez de nombreuses espèces végétales. L'existence de ces variations spontanées a stimulé l'intérêt de la culture de cellules ou de tissus pour l'isolement de plantes présentant des caractéristiques nouvelles. Technique  Les radiations ionisantes  La mutagenèse chimique  La variation somaclonale ou les vitrovariants Les radiations ionisantes C'est la source principale de création de mutants. Ces mutants ne donnent pas toujours directement de nouvelles variétés, mais les plantes obtenues peuvent être des géniteurs qui entrent dans un programme de croisements. La mutagenèse chimique Des produits mutagènes inclus dans les milieux de culture peuvent induire des mutations intéressantes au niveau horticole ou agronomique. La variation somaclonale ou les vitrovariants Le passage par cal ou le nombre de cycles de culture in vitro sont des facteurs qui peuvent induire des variants, c'est à dire des plantes dont le génome est sensiblement différent de celui de la plante de départ. Il est possible de créer de la variabilité via les cultures cellulaires également, cette voie est explorée chez l'asperge par exemple. Applications Des mutants ont été créés par exemple chez les céréales. On a pu créer par mutagenèse un colza avec une meilleure résistance à l'alternaria, (une maladie fongique). Pour de nombreuses espèces cultivées: tabac, tomate, céleri, canne à sucre, fenouil, laitue, etc. des variations somaclonales ont amené de nouveaux caractères intéressants: résistance aux maladies, précocité de floraison, couleur et forme des fleurs, accroissement de vigueur.

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Limites Les modifications apparaissent aléatoirement sur les chromosomes et la proportion de mutants présentant un intérêt horticole ou agronomique est faible. Dans quelques cas cependant, l'existence de cette variation somaclonale a permis d'isoler des plantes présentant des caractères intéressants d'un point de vue agronomique. Par exemple, des plants de canne à sucre présentant un taux de sucre plus important ont été isolés. De même, des génotypes résistants à certains virus, ont été obtenus chez la tomate et la pomme de terre (Evans 1989).

CHAPITRE VI : L'HAPLO-DIPLOIDISATION Introduction Les plantes haploïdes sont issues d'une cellule sexuelle mâle ou d'une cellule sexuelle femelle sans fécondation. Les plantes obtenues n'ont qu'un seul lot de chromosomes au lieu de 2 normalement, qui est doublé naturellement ou artificiellement afin qu'elles deviennent fertiles. Elles peuvent être obtenues par androgenèse, par gynogenèse, par fécondation avec du pollen irradié ou par croisements interspécifiques. Il existe dans la nature à des pourcentages très faibles des plantes haploïdes, non issues de fécondation normale. 72

L' ANDROGENESE ou les plantes "sans mère" Technique C'est la régénération de plantes entières à partir de culture de cellules sexuelles mâles: des grains de pollen immatures, soit par culture de pollen isolé, soit par culture d'anthères. Objectif Obtenir des plantes haploïdes doublées, (après doublement spontané ou artificiel par colchicine). Ainsi des lignées pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 à 10 ans par technique classique d'autofécondations. L'obtention de lignées pures est une étape presque toujours nécessaire des programmes d'amélioration des plantes. Applications C'est une technique utilisée chez le blé, le riz, la pomme de terre, le colza, le tabac, le maïs, l'asperge, le piment, etc. Le blé Florin a été la première variété issue d'androgenèse inscrite au catalogue français. Ce fut une première mondiale initiée par le laboratoire d'Amélioration des Plantes d'Orsay. Aujourd'hui de nombreux cultivars de diverses espèces et issus de ces techniques d'haplo-diploïdisation sont déposés chaque année.

ETAPES de l'ANDROGENESE du BLE TENDRE (Triticum aestivum) Avantages et limites de l’androgenèse Avantages Cette technique amène un important gain de temps, ce qui permet de mettre plus rapidement sur le marché de nouvelles variétés présentant des avantages pour l'agriculteur, l'industriel ou le consommateur. En effet une plante homozygote est directement obtenue, ce qui évite de faire une dizaine de générations d'autofécondations pour obtenir une lignée pure, état nécessaire aux programmes de sélection végétale.

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Les plantes obtenues par cette technique sont totalement homozygotes, cela permet de dévoiler des caractères intéressants par l'expression des allèles récessifs habituellement cachés. Ces gènes pouvant être exploités éventuellement. Des recombinants intéressants peuvent ainsi être détectés. Limites Le rendement, (nombre de plantes viables/100 anthères cultivées) est souvent dépendant du cultivar. Certaines variétés de céréales produisent un grand nombre de plantes albinos, donc non viables. La GYNOGENESE ou les plantes "sans père" Technique On cultive des ovules ou des ovaires non fécondés, le plus souvent immatures, sur un milieu artificiel. On obtient des plantules ayant un seul stock de chromosomes. Objectif L'objectif est le même que pour l'androgenèse. Mais la gynogenèse est souvent utilisée chez les espèces qui sont récalcitrantes à l'androgenèse. Application C'est une technique utilisée chez la betterave sucrière, le riz, la laitue, la pastèque, le pommier, le triticale, le tournesol, etc. Avantages Les risques d'obtention de plantes albinos sont fortement diminués voire nuls.

Les autres techniques de gynogenèse: o Les croisements interspécifiques o Pollinisation avec du pollen irradié Les croisements interspécifiques En fécondant un ovule avec du pollen d'une autre espèce, souvent sauvage et proche, il y a développement d'un embryon mais élimination des chromosomes de l'espèce sauvage. La plantule qui se développe est haploïde.

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C'est une technique largement utilisée chez l'orge, (Hordeum vulgare X Hordeum bulbosum), mais également chez le blé et la pomme de terre (Solanum tuberosum X Solanum phureja). Pollinisation avec du pollen irradié Irradier du pollen le rend inactif mais néanmoins capable d'initier des divisions cellulaires de l'ovule. Ceci permet l'obtention d'une plantule sans fécondation donc également avec le seul lot de chromosomes maternels. Les fruits qui se développent, par parthénogenèse, n'ont pas de graines ou de pépins. Ce qui est intéressant pour le melon ou la pastèque par exemple. Cette technique est utilisée chez le melon, le pétunia, l'asperge, l'oignon, la pastèque.

→ CHAPITRE VII : PRÉPARATION ET MISE EN CULTURE DE

PROTOPLASTES Les protoplastes, c'est quoi? Définition : Les protoplastes sont des cellules végétales sans paroi, obtenues expérimentalement par digestion de la paroi pecto-cellulosique.

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Intérêt : Comme elles n'ont plus de paroi, ces cellules se prêtent à divers types d'expérimentation (introduction de matériel génétique étranger, fusion interspécifique, étude électro-physiologique de la membrane plasmique, etc.) Matériel biologique Feuilles de chou rouge et feuilles de poireau. Le chou rouge et le poireau ont été choisis pour leur grande résistance. Ils possèdent une cuticule épaisse qui les protège de la déshydratation même si on les oublie un peu longtemps sur la paillasse. Pour les fusions, les protoplastes sont facilement reconnaissables. Les protoplastes de poireau sont verts grâce aux chloroplastes bien visibles. Les protoplastes de chou rouge ne sont pas chlorophylliens ; ils sont rouges grâce aux anthocyanes contenus dans leurs vacuoles. Préparation du matériel biologique Faire des lamelles tangentielles fines dans une feuille de chou rouge et placer les lamelles immédiatement dans la solution enzymatique, la face sectionnée contre la solution. Enlever l'épiderme d'une feuille de poireau sur une petite surface (1 cm2). Découper le morceau dénudé et le poser sur la solution enzymatique, la face dénudée vers le bas. Répéter l'opération jusqu'à recouvrir la surface de la boite avec les morceaux de feuilles. Incubation Fermer les boîtes de Pétri avec leur couvercle et placez les à l'étuve à 25°C. Durée de l'incubation : au minimum 3 h, donc préparer le matin pour un TP du soir. Pour obtenir beaucoup de protoplastes, préparer la veille mais attention, les protoplastes sont fragiles et les milieux peuvent s'infecter (bactéries). Préparation de chambres humides Sur une lame d'histologie, placer 2 lamelles séparées de 1 cm. Poser à la pipette une goutte de suspension cellulaire à étudier entre les deux lamelles. Placer une troisième lamelle à cheval sur les deux premières pour observer la préparation.

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Etapes de la formation de protoplastes chlorophylliens à partir de mésophylle de feuilles de poireau Réalisation de fusions Protocole Dans une chambre humide, déposer une goutte de suspension de protoplastes de chou rouge et une goutte de suspension de protoplastes de poireau. Mélanger délicatement avec la pointe de la pipette ou une spatule fine. Ajouter une goutte de la solution de PEG et mélanger délicatement. Recouvrir d'une lamelle et observer immédiatement. Lorsque vous observez un accolement particulièrement intéressant, restez sur cette observation en attendant la fusion complète des cytoplasmes. Principe de l'hybridation somatique par fusion de protoplastes. Observation d'accolement ou de fusions En théorie, la fusion permet d'obtenir toutes les combinaisons. Dans la réalité, de nombreuses régulations ont lieu au moment de la première mitose, rendant impossibles certaines combinaisons. De plus, ce n'est pas parce qu'il y a fusion qu'il y a addition des noyaux et des cytoplasmes. Il se produit des éliminations de matériel, dont les mécanismes sont inconnus. Avec l'hybridation sexuée, entre deux espèces végétales voisines, deux compartiments génétiques ne seront pas exprimés dans l'hybride : les plastes et les mitochondries, qui sont hérités par la mère. Avec l'hybridation somatique, en fusionnant deux protoplastes d'espèces différentes, plus ou moins proches, les deux cytoplasmes peuvent s'exprimer dans la cellule obtenue, c'est-à-dire confronter les génomes chloroplastiques et mitochondriaux. Une variabilité génétique inaccessible par les voies classiques est alors disponible. Or de nombreuses résistances sont d'origine chloroplastique ou mitochondriale, donc difficilement transférables par les voies classiques. A l'aide de l'hybridation somatique, Des résistances contenues dans les espèces sauvages ont pu être introduites dans une souche cultivée. Exemples L'hybridation entre Nicotiana tabacum et N. rustica a permis le transfert au tabac cultivé de la résistance au feu bactérien. 77

L'hybridation entre Brassica napus et B. hirta a permis le transfert, de la moutarde blanche au colza, des résistances à l'Alternaria et aux Nématodes. Obtention d'un colza mâle stérile et résistant à l'atrazine. L'introduction de la mâle stérilité chez le colza, par croisement avec le radis, conduisait à une déficience chlorophyllienne et à une sous production de nectar. Après fusion entre protoplastes d'une lignée normale de colza et une lignée mâle stérile, il a été possible de sélectionner des hybrides possédant le noyau de colza, les mitochondries du radis et les chloroplastes du colza, donc une synthèse chlorophyllienne normale. De la même manière, on a introduit la résistance à l'atrazine de Brassica campestris chez le colza. Les limites de cette technique Le frein essentiel à la mise en oeuvre de ces technologies est la difficulté de régénération d'une plante entière à partir de protoplastes, en particulier chez les Céréales et les Légumineuses, groupes à grand intérêt agronomique. L'élimination plus ou moins complète d'un stock chromosomique lors de la fusion de protoplastes entre espèces différentes conduit à l'instabilité de l'hybride. Cependant, il peut rester quelques traces du génome éliminé, et l'hybridation somatique interspécifique peut alors être un moyen rapide d'introduire des gènes étrangers au sein d'une espèce. Ces manipulations restent un peu aveugles dans la mesure où la qualité des modifications introduites est mal contrôlée. Il existe une variabilité somaclonale importante. Les plantes régénérées peuvent être stériles, à cause de l'hérédité cytoplasmique. Ce phénomène limiterait beaucoup l'intérêt de la technique.

Perspectives de cette technique Grâce à la fusion des cytoplasmes, on peut envisager de faire des études génétiques sur les mitochondries et les chloroplastes. Applications agronomiques : Possibilité de prendre en compte les mitochondries et les chloroplastes dans les mécanismes de résistance aux herbicides et aux conditions défavorables du milieu.

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Maîtrise de caractères importants tels que la stérilité mâle (souvent portée par les mitochondries), utile pour les espèces pour lesquelles la production de semences hybrides représente un objectif majeur.

AVANTAGES DE LA CULTURE IN VITRO La culture in vitro permet :  l’obtention de clones sélectionnés pour leur vigueur, leur caractères intéressants (Chrysanthème, Fraisier, Bananier), leur rareté (Orchidées) ;  l'assainissement des végétaux (plantes sans virus) : la Pomme de terre ;

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 la production rapide et en masse, à n'importe quel moment de l’année, alimentaires et pharmaceutiques. Le raccourcissement des cycles de développement  la diminution des coûts de production (peu de personnel) et des dépenses énergétiques (réduction des surfaces de culture et éclairement réduit) ;  la facilité de stockage et conservation (au froid) de millions de plantes sur de très petites surfaces, à l'état sain et à l'abri des contaminations ;  le rajeunissement d’un végétal ;  la production de substances biochimiques intéressantes pour l'industrie, les secteurs alimentaires et pharmaceutiques.

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