Sod
Content
SUPEROKSID-DISMITAZA (SOD)
Rastvori:
1. 0,02 M HCl
1,72 ml konc. HCl
dH2O do 1L
2. 0,05 M NaHCO3-/CO32- pufer pH 10,25 sa 1x10-4M EDTA
4,2 g NaHCO3
500 µl 200 mM EDTA
dH2O do 750 ml
Dotitrovati pH na 10,25 (početni je oko 8,5) sa NaOH.
Dopuniti do 1l, sterilno profiltrovati.
3. 0,01 M Epinefrin u 0,02 M HCl
45,8 mg epinefrina
0,02 M HCl do 25 ml
Priprema uzorka:
-200 µl eritrocita je lizirano sa 3 zapremine hladne vode (pi). Ostavljeno 15 minuta da stoji u
frižideru.
1. Pripremljen ragens za ekstrakciju koji sadrži etanol i hloroform u odnosu 62,5:37,5 (V:V) i
držan na 4 ºC (31,3 ml etanola + 18,7 ml hloroforma)
2. Dodaje se 400 µl ovog reagensa na 250 µl lizata u ependorficu. Vortex 30 sekundi,
centrifugiranje 3000 g (7000 rpm) na 4 ºC, 5 minuta.
3. Sakupiti gornji vodeni sloj.
4. Ekstrakt se može čuvati u frižideru na 2-8 ºC 24h. U suprotnom zamrznuti.
Merenje V0- brzine autooksidacije epinefrina ( A=485 nm)
1. 1950 µl NaHCO3-/CO32-, podesiti nulu.
2. 50 µl epinefrina, promešati, meriti.
Merenje VSOD- stepen inhibicije autooksidacije adrenalina SOD-om
1. 1850 µl NaHCO3-/CO32- pufera
2. 50 µl smeše uzorka i pufera:
10 µl uzorka + 40 µl pufera
20 µl uzorka + 30 µl pufera itd.
3. 50 µl epinefrina.
Promešati i meriti A na 485 nm.
Promešati i podesiti nulu.
Rastvori:
1. 0,02 M HCl
1,72 ml konc. HCl
dH2O do 1L
2. 0,05 M NaHCO3-/CO32- pufer pH 10,25 sa 1x10-4M EDTA
4,2 g NaHCO3
500 µl 200 mM EDTA
dH2O do 750 ml
Dotitrovati pH na 10,25 (početni je oko 8,5) sa NaOH.
Dopuniti do 1l, sterilno profiltrovati.
3. 0,01 M Epinefrin u 0,02 M HCl
45,8 mg epinefrina
0,02 M HCl do 25 ml
Priprema uzorka:
-200 µl eritrocita je lizirano sa 3 zapremine hladne vode (pi). Ostavljeno 15 minuta da stoji u
frižideru.
1. Pripremljen ragens za ekstrakciju koji sadrži etanol i hloroform u odnosu 62,5:37,5 (V:V) i
držan na 4 ºC (31,3 ml etanola + 18,7 ml hloroforma)
2. Dodaje se 400 µl ovog reagensa na 250 µl lizata u ependorficu. Vortex 30 sekundi,
centrifugiranje 3000 g (7000 rpm) na 4 ºC, 5 minuta.
3. Sakupiti gornji vodeni sloj.
4. Ekstrakt se može čuvati u frižideru na 2-8 ºC 24h. U suprotnom zamrznuti.
Merenje V0- brzine autooksidacije epinefrina ( A=485 nm)
1. 1950 µl NaHCO3-/CO32-, podesiti nulu.
2. 50 µl epinefrina, promešati, meriti.
Merenje VSOD- stepen inhibicije autooksidacije adrenalina SOD-om
1. 1850 µl NaHCO3-/CO32- pufera
2. 50 µl smeše uzorka i pufera:
10 µl uzorka + 40 µl pufera
20 µl uzorka + 30 µl pufera itd.
3. 50 µl epinefrina.
Promešati i meriti A na 485 nm.
Promešati i podesiti nulu.
