)TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASES-1 (TIMP-1
INHIBITS TUMOR GROWTH AND ANGIOGENESIS IN THE
TIMP-1 TRANSGENIC MOUSE MODEL
)(Workshop: Transgenic models in angiogenesis
hTIMP-1: (human) tissue inhibitor matrix metalloproteinases-1
TIMPמוכר כחלבון מולטי-פונקציונלי .תפקידו בסרטן לא ידוע ,נתקבלו דיווחים סותרים:
anti tumor activity .1
tumor growth stimulation .2
המחקר המתואר :יצירת גן TIMPהנתון לבקרת אלבומין וביטוי ברקמת הכבד של עכברים
(פרומוטר+מעצם ,ייקרא בשם .)TIMP-Tg-mice :קבוצת הבקרה :עכברים הטרוזיגוטיים
לגן החדש .הושתל גידול סרטני (ארליך) בעכברים.
:In vivoהגידול דוכא (ע"י עצירת התפתחות כלי דם חדשים באזור) בעכברים הטרנסגנים,
במידה רבה יותר מאשר בקבוצת הבקרה.
:In vitroהגן לא השפיע על שגשוג תאי אנדותל (שכבה דקה של תאי ציפוי) ושגשוג תאי
הגידול .לכן נסיק כי האפקט המדכא לא נובע מרעילות .הגן דיכא משמעותית יצירת תאי אנדותל
צינוריים.
מעבר לכך in vitro ,לא חל שינוי ברמות )matrix metalloproteinase (MMP
אולם כן נצפה שינוי במרקר הזה ( in vivoבעכברים ההומוזיגוטיים לעומת קבוצת הבקרה
הטרוזיגוטית).
מכל האמור לעיל ,נשער כי TIMPמדכא את ביטוי הסרטן ע"י דיכוי השלבים המאוחרים של
אנגיוגנזה (כנראה בעקיפין) TIMP .פועל בהתחלה להגברת הגידול (ע"י מניעת אפופטוזיס),
ולאחר מכן מדכא את הגידול.
Cell-type-specific gene delivery into neuronal cells in vitro
and in vivo
)(Workshop: Gene Therapy II
המחקר מדגים העברת גנים ספציפית לתאי עצב .עד למחקר ,היו קיימות שיטות שהראו העדפה מסויימת
לתאי עצב ,בהזרקה ישירה למוח ,אך לא היתה בנמצא שיטה להדביק ספציפית תאי עצב.
לכן ,יש צורך להנדס מעטפת חלבונית לוירוס ,שתיקשר לתא-מטרה ידוע (=תא עצב).
כדי להעצים את ההדבקה ואת הספציפיות ,השתמשו במרכיבים:
gag.1של וירוס עופות ()Rev-A
Pol.2של )SNV )spleen necrosis virus
envelope protein.3של )VSV )vesicular stomatitis virus
.4גליקופרוטאינים של וירוס הכלבת ( ,)RVשידוע כבעל זיקה עצבית גבוהה
NLS.5הוחדר ,כדי לאפשר הדבקה של תאים "שקטים" – בשלב .)G0 )quiescent
לא בטוח שניתן להדביק תאים אלו גם .in vivo
– neo.6עמידות לאנטיביוטיקה ניאוצין.
:MHC Class Iקיימים על פני שטח כל תא בגוף .מציגים כלפי חוץ סימן למערכת החיצונית ,אם קיים
בתוך התא וירוס – או לא.
טיפולים נוכחיים לסרטן שלפוחית השתן (כמו )BCGכוללים הגברת פעילות של ציטוקינים .אבל טיפול זה
בעל תופעות לוואי מרובות ,וכשליש מהמטופלים כלל אינם מגיבים אליו.
שימוש בציטוקינים רקומביננטים יקר ,ודורש חזרות מרובות משום שהציטוקינים אינם יציבים (זמן מחצית
חיים בשלפוחית קצר מאוד) .בנוסף ,האפקט של הציטוקין הרקומביננטי מוגבל ,משום שלבקטריה אין יכולת
לבצע מודיפיקציות שלאחר-טרנסקריפציה (הדרושות לציטוקין) .לכן כדאי להשתמש בהדבקת התאים
בשלפוחית בגן קבוע שמייצר ציטוקין .הטיפול ה"רגיל" (באמצעות אדנו-וירוס) אינו יעיל במקרה זה ,משום
שאין בשלפוחית השתן קולטנים לאדנו-וירוס במידה מספקת .לכן בוצע שימוש בליפוזומים.
בניסוי המתואר הוחדרו שני ציטוקינים:
:IFN-α1גליקופרוטאין ,מבקר גידול תאי ,התמיינות ,מדכא ביטוי אונקוגנים ,תומך אפופטוזיס ,מפעיל
לימפוציטים ומקרופאג'ים .בפרט :מסוגל לדכא גידול ע"י מניעת יצירת כלי דם חדשים.
:GM-CSFמעורר שגשוג/התבגרות/תיפקוד של תאי דם.
מטרת הניסוי :לבדוק את יעילות העברת ציטוקינים ככלי ריפוי.
תוצאות :לאחר ההדבקה ,נצפתה עליה ברמת הציטוקינים לעומת הדבקה בוקטור בלבד – שבה אין עלייה
בציטוקינים .עליה ברמת MHC Class Iבתאים .דיכוי גדילת תאים סרטניים שהודבקו בציטוקינים.
ניסויים in vivoתמכו בתוצאות המתוארות למעלה.
מבחינת ריפוי בעזרת ציטוקין :בקבוצת הבקרה שרדו פחות עכברים מאשר בקבוצות הניסוי ( .)69%מתוך
שלוש קבוצות הניסוי ,לשתיים החדירו סוג אחד של ציטוקין שונה ( 77ו 92-אחוז הישרדות) ,ולקבוצה
השלישית החדירו שילוב של שני הציטוקינים (ואחוז ההישרדות היה .)100החוקרים השתמשו במספר
אמצעים כדי לוודא שהגידול היה מוגבל לתחום השלפוחית (בדיקה שלאחר-המוות וכו') ,וגם וידאו שלא היתה
רעילות לתאים (לא היה שינוי במשקל הגוף בקבוצה המטופלת).
נקודות נוספות בניסוי:
.1החוקרים הצליחו להחדיר סרטן לרקמה ספציפית ,בלי ליצור גרורות בטכניקה של צריבת
האזור ,והדבקת האזור הצרוב בתאים סרטניים .שיטות אחרות לא מפיקות תוצאות כאלו.
.2הדבקה באמצעות ליפוזום .בעזרת הגן המדווח נצפתה הדבקה גם בשכבות העמוקות-פנימיות
של הגידול ,בעוד שהדבקה עם אדנו-וירוס נותנת הדבקה שטחית בלבד .סברה :שכבה של תאי
אפיתל שהתמיינו לחלוטין מהווה מחסום בפני ההדבקה הויראלית.
**** הערה שלי :לפני החדרת ציטוקין נרצה לבדוק שהוא באמת משתתף פעיל בדיכוי הסרטן ,או בכלל
ללמוד את השפעתו ,כדי שנוכל לבדוק אותה .in vivoאם מחדירים שני ציטוקינים ,כדאי לבדוק אם הם
פועלים יחד או לא.
Fine mapping of the 2p11 dyslexia locus
and exclusion of TACR1as a candidate gene
)(SNPs workshop
דיסלקציה מיוחסת לחמישה גנים לפחות.
מיפוי של ,2q11לוקוס של ליקויי למידה וביטול של ( tachykinin receptor1)TACR1כגן
מועמד.
מחקרי עבר מצאו קישור ללוקוס זה .מטרת המחקר היא למצוא ברזולוציה גבוהה מיפוי של כ 40-ס"מ אזור
המקושר בכרומוזום 2ולצמצם את האזור החשוד בקשר באמצעות SNPsוסמני .microsatellite
- microsatelliteמשטחים חוזרים של מקטעי DNAקצרים המשמשים כסמנים גנטיים לאיתור תורשה
במשפחות.
התבצע מיפוי באמצעות מבט על משפחות פיניות microsatellite markers 21 ,וSNPs 6-
. markersבאמצעות הגלאים הללו התבצע עידון של האזור המעורב לכדי 10.5ס"מ.
– TACR1גן המקודד G-protein receptorל tachkinin-ומעורב בפעילות עצבית ומצבי רוח,
נבחן ברמת מוטציות כגן שיכול להשפיע על המחלה כיוון שהוא ממוקם באזור המעורב .כיוון שלא התגלו
מוטציות אצל הנחקרים ומכיוון שלא נמצאו haplotypesשונים באזור שנבחן ע"י SNPs 6הממוקמים
בגן זה או סביבתו ,הוסק שאין השפעה לגן על המחלה.
על מנת לנתח את המבנה התורשתי כללי השתמשו ב MA-וב .SNP-ה SNPs-נבחרו ממאגרי SNPs
ידועים בבני אדם וכאלו הידועים בקרבתם לחלק המקודד של .TACR1
מסריקה של הכרומוזום ע"י מספר גלאים ,נעשתה בדיקה סביב האזור בו הסמן היה הכי דומיננטי אצל
החולים .כיוון שסמן זה היה במיקום המקודד את TACR1ניסו למצוא מוטציה בגן הגורמת למחלה .עם זאת
לא נמצאה אף מוטציה בגן .נמצא פולימורפיזם לשני SNPsאך לא נמצא קשר ביניהם למחלה בנפרד ואף לא
כ .Haplotype -גם לאחר הוספת סריקה עם SNPsנוספים לא נמצא קישור של הגן במחלה אך הצליחו
לצמצם את האזור המעורב על הכרומוזום.
Positional cloning of the major quantitative trait
locus underlying lung tumor susceptibility in mice
)(Positional Cloning workshop
QTL – Quantitative Trait Locus
תפקוד ומיקום משוער של הגן ידועים ומחפשים אחר הגן עצמו.
מטרה :זיהוי גנים שעשויים להיות הגורמים לרגישות לסרטן הריאות ע"י טכניקת .positional cloning
ידוע כי נוסף על גורמים סביבתיים ,יש מרכיב גנטי במחלה .אולם ,ההטרוגניות הגנטית יחד עם תנאי הסביבה
המשתנים בין חולה לחולה מקשים על הנסיון לזהות לוקוסים .לכן ,מבוצעים מחקרים על חיות מודל –
עכברים .מחקרים קודמים מיקמו את אחד הלוקוסים התורמים בשם pas1על מקטע מסויים בכרומוזום .6
תהליך :המקטע של Pas1נלקח מזן של עכברים שידוע כרגיש במיוחד ( )A/Jלסרטן הריאות .המקטע
הונדס ,ונתחם ע"י שני מרקרים ידועים ,והושתל בזן אחר ( ,)C57BL/6Jשידוע כמתנגד לסרטן הריאות.
בוצעו הכלאות חוזרות ( )repeated backcrossesעם דור ההורים הראשון ,ובדור ה 8-נלקחו 132
זכרים ,כל אחד מהם מכיל מקטע שונה של הכרומוזום .זכרים אלה עם 3נקבות מאותו הזן המקורי שחסין
(יחסית) לסרטן הריאות ,והעמידו את הדור ה .9-דור זה היה ( congenicכל הפרטים זהים גנטית ,פרט
ללוקוס בודד).
.1מבין עכברי הדור ה ,9-נבררו עכברים מסויימים ,על-סמך מרקרים גנטים ידועים .עכברים אלו
הודבקו בסרטן בגיל 5שבועות ,והומתו 7.5חודשים לאחר-מכן .הגידולים הסרטניים הוסרו,
ונמדדו (מספר ,נפח) .כמו-כן ,נמדדו השונויות בין הקבוצה המטופלת לבין קבוצת הביקורת.
.2רנ"א נלקח מתאי הריאות של העכברים .בוצע RT-PCRואנליזת .Northern Blot
הקבוצה המטופלת פיתחה 6גידולים בנפח 1.91מ"מ מעוקב בממוצע לעכבר לעומת 0.7גידולים בנפח
ממוצע 0.18מ"מ מעוקב בקבוצת הביקורת .בצורה זו ,צומצם האזור הראשוני מ 32-מ"ב ל 0.5מ"ב.
באזור שנמצא 12 ,גנים משוערים .ביטוי של 6מתוכם ברקמת הריאה אכן אושר ,ע"י PCRונורת'-בלוט.
לאחר מכן ,בוצע חיפוש ל -functional polymorphismואכן נתגלו 5גנים שהכילו פולימורפיזם
כזה ,או לחלופין הראו ביטוי שונה בין שני הזנים (הרגיש לסרטן והחסין לסרטן) 5 .גנים אלו הפכו
למועמדים סופיים לגן .כדי לברור מי מהם בדיוק ,נעשו ניסויים בהם בדקו מי מבין 5הגנים מדכא/מעורר
גידול סרטני ב cell lines-של עכבר .רק אחד ענה לדרישות .Las1 :כשהשתמשו ב Las1מהזן הרגיש
לסרטן ,נוצרו גידולים סרטניים .לעומת זאת Las1 ,שנלקח מהזן החסין מנע כל גידול סרטני (in vivo
.)and in vitro
נתגלה כי פולימורפיזם מסויים ( AGTלעומת AATבקודון )60קיים בזנים העמידים ,לעומת הזנים
הרגישים והרגישים למחצה .לאחר מכן בדקו החוקרים את המיקום בתא בו Las1מתבטא ,ומצאו
הומולוגים במינים אחרים.
החוקרים הגדילו ראש ,ובדקו מועמד נוסף מבין 5הגנים ,למרות שלא נצפתה בו functional
:polymorphismהגן Kras2אלא רק ביטוי מוגבר של אחד האללים .מסקנות :ביטוי הגן לא משפיע
על מספר הגידולים ,אבל תורם לנפח מוגדל שלהם .לאחר בדיקה נוספת ,החוקרים גילו כי Kras2שהגיע
מהזן הרגיש ,מתבטא יותר בגידול סרטני ,מאשר האלל שהגיע מהזן החסין.
Adenovirus-mediated Gα q-protein antisense transfer in
neurons replicates Gα q gene knockout strategies
מושגים:
• :Antisenseמנגנון המונע ביטוי גן ע"י התערבות בשלב התרגום
• :G-proteinמשפחת חלבונים הטרו-טרימריים ,הנמצאים בחלק התוך-תאי של הממברנה.
החלבונים קושרים אליהם רצפטורים ובאמצעות שינוים מבניים והידרוליזה של GTPגורמים
לשינוי במצב התעלות בתא (במישרין או בעקיפין) ,ובכך מצמדים תגובות פנים-תאיות
לרצפטורים על גבי התא.
•אדנווירוס :וירוס הגורם לדלקות בדרכי הנשימה ובעיניים.
• :Ganglionגנגליון ,צבר תאי עצב
רקע:
שינוי תבניות ביטוי של גנים באמצעות אסטרטגיות antisenseהוא נושא שראוי לבחינה ,הן מנקודת מבט
רפואית-טיפולית ,והן מנקודת מבט מחקרית .גישות antisenseמנוצלות בשיעור גבוה בניתוח של signal
pathwaysבין רצפטורים על גבי התא ,ובין גורמים פעילים בפנים התא ,והן יעילות במיוחד הודות
לספציפיות הגבוהה שלהן.
מוטיבציה:
מחקרים קודמים איפשרו לזהות את תתי-היחידות של G-Proteinהמעורבים בדיכוי M-Channelsשל
אשלגן ,וב -N-channelsשל סידן ,ב SCG-של עכברוש .אולם התוצאות שהופקו מגישות אלו סבלו
מהגבלות ומאי-דיוקים :תוצאות של oligonucleotides antisenseלא היו עקביות ,ושימוש ב cDNA
Expression Vectorחייב הזרקה לפנים-הגרעין או הדבקה של תת-אוכלוסיה בשלב מיטוזה .היה צורך
ממשי בשיטה חדשה שתאפשר העברת הגן לאוכלוסיות תאים גדולות ולתאי עצב פחות סובלניים לשיטות
ההחדרה הקודמות.
שיטות:
•מושבות תאים :נוירונים מ SCG-הופרדו מעכברושים צעירים ז"ל (בני 15-19יום) ,וגודלו
על זכוכיות .העכברושים הומתו בעריפת ראשם ,לא לפני ששאפו כמות נכבדת של פחמן-דו-
חמצני – והכל ע"פ חוק בע"ח הבריטי (.)1986
•ייצור אדנו-וירוס רקומביננט וההדבקה :רצף ה antisense-תואם לנוקלאוטידים 29-129
בקצה '3של ה UTR-בגן הרלבנטי בעכברוש .הרצף ייחודי ל ( Gαq -proteinגם על פני
יחידות אלפא אחרות) .הוירוסים הודבקו באמצעות פלסמיד והוגברו במשך ארבעה מחזורים.
ההדבקה אושרה באמצעות בדיקת רצפים ובאמצעים נוספים (כמו ה GFP-גן מדווח) בנוסף,
נעשה שימוש בקבוצת מבחן של וירוסים שלא הודבקו במולקולת האנטי-סנס.
• :Immunofluorescenceשימוש בצבע פלורוסנטי הקשור לנוגדנים לצורך זיהוי או כימות
אנטיגנים.
תוצאות:
•נמצא ריכוז וירוסים שיתן הדבקה אופטימלית של נוירונים ,בפרק זמן סביר.
•לאחר ההדבקה ,נבדקה התפתחות פתולוגית ע"י הדגרת התאים המודבקים יחד עם צבע הנבלע
ע"י תאים עם ממברנה פגומה ,ונקשר לחומצות גרעין ( .)nucleic acidsהצבע ניתן בריכוזים
משתנים .הריכוז שנבחר לבסוף לביצוע כל הניסויים הוא זה שנתן תאים חיים במשך זמן רב
ביותר.
•שיעור ההדבקה (כאשר נעשה שימוש בריכוז וירוסים אופטימלי :שיעור הדבקה גבוה ושיעור
פתוגני נמוך) עמד על למעלה מ 60%-במושבה הראשית ,ורוב התאים ב cell line-הודבקו אף
הם .זהו שיפור גדול לעומת ההזרקה התוך-גרעינית ,בה הזריקו למספר תאים בכל פעם.
•ברוב התאים המודבקים ,ניתן היה לראות ירידה ברורה של ביטוי Gαqבהשוואה לקבוצות
הבקרה.
• Gαqהכרחי לתפקוד תקין של תעלת הסידן בתא .בתאים שהודבקו בוירוס ,חלה ירידה ניכרת
בשחרור סידן ממאגרי התא.
דיון:
•אדנו-וירוס רקומביננטי יכול בהצלחה להעביר אנטי-סנס למושבות,
•ההעברה מתבטאת בהפחתה ספציפית של תת-היחידה הרלבנטית ,וכתוצאה ישירה מכך נגרמת
הפחתה בפעילות המתווכת ע"י תת יחידה זו.
•החדרת אנטיסנס ויראלית משכפלת תוצאות שהושגו באמצעות אסטרטגיות השתקה אחרות.
סיכום:
•שימוש באדנו-וירוס רקומביננטי כדי להעביר אנטיסנס של G-Protein αqלנוירונים בSCG-
(גנגליון) של עכברוש ,ול cell lines-נוירונליים.
•הטרנספקציה בוצעה כדי לפענח תהליכים הקשורים לחלבון הנ"ל ולמערכת העברת האותות
התאית .התוצאות הושוו לאסטרטגיות השתקה ( )knockdownמוכרות של Gαq )antisense
)plasmid, knockout mouseואכן נתגלה מתאם גבוה של חזרה על התוצאות.
•הדבקות ב -GαqASAdVהורידו בצורה סלקטיבית את האימונו-ראקטיביות לחלבון .ביטוי G
αProteinאחרים לא שונה.
A Preliminary Transcriptome Map of Non-Small Cell Lung Cancer
()Transcriptome Workshop
SAGE = Serial Analysis of Gene Expression
בניית מפת הטרנסקריפטום :נלקח מידע מספריות ,SAGEטויטת הגנום ,מאגרי מידע ציבוריים ועוד.
כל tagבמידע זוהה ייחודית לגן אחד (חזרות נמחקו).
באמצעים מתמטיים-סטטיסטיים ,חולקו הגנים לצבירים ( )clustersע"פ תבנית ההתבטאות שלהם ביחס לשני
סוגים של סרטן ,ולרקמה בריאה.
מתוך טיוטת הגנום :הגיעו החוקרים ל -27,542קלאסטרים ,מתוכם ל 26,992-היתה התאמה ייחודית למיקום
בכרומוזום כלשהו .מספר זה מתיישב עם הערכת הגנים בגנום (.)25k-40k
מתוך ספריות SAGE: 374,643 tagsנלקחו מ 9-ספריות .ראשית נבחרו טאגים בעלי זיקה לרקמות הריאה
ואפיתל של מערכת הנשימה .צמצום נוסף נעשה ע"י מחיקת טאגים שמקושרים לדנ"א מיטוכונדריאלי ,או
לרנ"א ריבוזומלי .הטאגים שהופיעו ביותר מספריה אחת נבחרו לטיוטה הסופית .בוצע מיפוי של הטאגים
לגנים .טאגים שמופו ליותר ממקום אחד – נמחקו גם כן .סתירה מסויימת במספר הקלאסטרים הסופיים
מיושבת ע"י ההשערה הבאה alternative splicing :ונוכחות של מספר אתרים לביצוע פוליאדנילציה
(=מוביל למספר טאגים של SAGEעבור גן בודד).
סה"כ ,נמצאו מספר אזורים בעלי ביטוי מוגבר (פי 3או )4ומופחת ( 50-65%מהנורמל) בהתאם לרקמה
(סרטנית או לא).
עבור סוג אחד של סרטן ( ,)adenocarcinomaנתגלו תבניות ביטוי מופחתות של קלאסטרים במתאם
סטטיסטי תקין .אולם ,תבניות ביטוי מוגבר נתגלה עם ,p=0.5652כלומר תיתכן אקראיות ולא ניתן להסתמך
על התוצאה .הסבר משוער למקדם המתאם:
.1בגלל המיקום של סרטן זה (היקפי) ,תבנית ביטוי הגנים שלו דומה לתבנית
הביטוי ברקמה לא-סרטנית.
.2מספר ה -SAGE tagsאינו מספיק לביצוע מחקר.
.3תת-סוגים רבים של סרטן זה.
לכן התמקדו החוקרים בסוג השני של הסרטן ,squamous tumors :עבורו נמצאו 15צבירים עם ביטוי
מוגבר ,ו 28-עם ביטוי מופחת.
איזורים מוגברים :מתוך 15האיזורים המוגברים 9 ,תואמים לתוצאות מחקרים קודמים .גנים שבעבר נחשבו
קשורים למחלה ,לא בוטאו כלל במחקר הנוכחי .רק הגן ( p63הומולוג של )p53נמצא כמועמד לגן משום
שהוא הוגבר במחקר הנוכחי ,והתוצאות תואמות למחקרים קודמים.
איזורים מופחתים :מתוך 28אזורים כאלה 13 ,תאמו למחקרים קודמים.
נמצאה חלוקה לא שווה של אזורים עם ביטוי דיפרנציאלי לאורך הגנום .אבחנה זו מתיישבת עם ידע קודם
בנוגע לכך ששינויים גנטיים משפיעים לרוב על סטים של גנים הממוקמים בקירבה פיזית .אפשר לנצל עובדה
זאת כדי לספק מרקרים חלופיים לסרטן .עם זאת ,אין להסתמך רק על כך משום שבכל קלאסטר ,היו מספר
גנים עם תבניות ביטוי שונות.
בעיות :לא כל הגנים המוגברים – מבוטאים ביתר (ולהיפך)
מפת הטרנסקריפטום שהוכנה ע"י החוקרים ,רגישה יותר לאזורים שמבוטאים ביתר .לא נצפה clustering
במספר אזורים שידוע כי הם נמחקים בסרטן .squamousאי-גילוי איזורים שנמחקו יכול להיות מוסבר בכך
שרמת הביטוי של אותם איזורים ,ממילא היה נמוך גם בנורמל .ניתן לראות נתונים אלו בטבלאות במאמר:
ביטוי-יתר מאופיין ע"י ביטוי של פי ,3-4לעומת ביטוי-חסר שמאופיין ב 50%-ביטוי מהנורמל .לכן סביר
להניח ,שגנים בביטוי-יתר מזוהים בקלות רבה יותר ,בעוד שגנים בביטוי-חסר מיוצגים פחות מדי במפה.
בנוסף לכל האמור לעיל ,דיוק המפה הנוכחית מוגבל ע"י דיוק טיוטת הגנום ,קריטריוני הצמצום שבוצעו
בתחילת התהליך.